EGFR外顯子19缺失突變促惡性甲狀腺腫瘤侵襲遷移作用的研究

張晶晶，夏玉娟，董順利，張 熠

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

甲狀腺癌占所有人類惡性腫瘤的0.5%～1%[1]，并且其發(fā)病率以每年5%～6%的速度持續(xù)上升[2]，臨床上治療包括濾泡型甲狀腺癌（follicular thyroid cancer, FTC）、未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid carcinoma, ATC）、低分化甲狀腺癌（poorly differentiated thyroid cancer, PDTC）在內(nèi)的惡性甲狀腺腫瘤，主要以手術(shù)以及手術(shù)后放射治療或放療與化療聯(lián)合的方式[2]，目前沒有很好的靶向治療手段[3]?？梢?，積極探索甲狀腺癌發(fā)生的分子機(jī)制可為靶向晚期或復(fù)發(fā)甲狀腺癌提供理論依據(jù)，改善患者的預(yù)后。

在晚期甲狀腺癌中，表皮生長因子受體（EGFR）通常過表達(dá)[4]。EGFR與甲狀腺癌的侵襲性和進(jìn)展有關(guān)[5]，也可積極參與甲狀腺癌晚期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為EGFR染色強(qiáng)度與乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer, PTC）的復(fù)發(fā)具有顯著相關(guān)性[6]。除過表達(dá)之外，EGFR突變也在甲狀腺癌中被發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，在1 例PTC患者中檢測到EGFR外顯子19的缺失突變（EGFR 19del）[7]；在1 例ATC患者中檢測到EGFR外顯子21 L858R突變[8-9]。因此，以EGFR為靶點(diǎn)的分子治療可能是表達(dá)EGFR的甲狀腺癌的合適選擇。

本研究旨在探討EGFR外顯子19缺失突變?cè)诩谞钕侔┲械淖饔?，研究外顯子19缺失突變的侵襲性行為，分析其在甲狀腺癌中的可能作用通路，討論EGFR外顯子19缺失突變是否可以成為甲狀腺癌患者有效治療的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 甲腺濾泡上皮細(xì)胞株（HTFEC）和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFR外顯子19缺失突變的細(xì)胞株（HTFEC-ex19 del）培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素（雙抗）和含有0.4 μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基（含谷氨酰胺），在37 ℃，5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)：對(duì)六孔板底部進(jìn)行標(biāo)記，待細(xì)胞密度長至90%左右時(shí)，10 μL移液槍槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行豎直劃痕，PBS洗滌細(xì)胞后加入無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下拍攝并記錄0 h的初始細(xì)胞劃痕面積。將細(xì)胞放在5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。之后于指定時(shí)刻內(nèi)，再次用倒置顯微鏡進(jìn)行拍攝。以傷口修復(fù)面積百分比（%）＝(初始細(xì)胞劃痕面積－某時(shí)刻的面積)/原始面積×100%，測定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。

1.2.2 Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)：對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞懸浮在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，緩慢加入到Transwell小室的上室（1×104個(gè)/室），下室加入含血清的正常培養(yǎng)基。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，用DMEM稀釋過的基質(zhì)膠（8:1）包被Transwell小室的上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中使基質(zhì)膠固化1 h。48 h后，用棉簽小心擦去膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞，室溫下4%多聚甲醛固定20 min，之后用含0.5%結(jié)晶紫70%乙醇溶液染色30 min，顯微鏡下拍攝（40×），并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 Western Blot：提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量，加入Loading Buffer，100 ℃變性10 min。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，封閉后，孵育一抗、二抗。使用Odyssey雙色紅外激光成像儀進(jìn)行掃描，采集圖像。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析（RNA-seq）：從HTFEC和HTFEC-ex19 del細(xì)胞中分別提取總RNA。按照制造商的說明，使用NEBNext? Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?制備RNA-seq文庫。進(jìn)行檢測，結(jié)果按照差異基因表達(dá)變化倍數(shù)（fold change,FC）變化2倍以上且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)生P＜0.05的差異表達(dá)基因熱圖，并進(jìn)行相應(yīng)的通路分析和基因功能分析，例如GSEA（gene set enrichment analysis）分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制作圖表。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Student'st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR外顯子19缺失是甲狀腺腫瘤患者中的一種潛在突變類型 我們收集了50 例包括FTC、髓樣甲狀腺癌（medullary thyroid carcinoma, MTC）、PDTC或ATC在內(nèi)的各種類型甲狀腺癌患者標(biāo)本（圖1A）?；驕y序分析顯示，2 例（4%）患者存在EGFR突變（圖1B），其中包括1 例EGFR 19 del（19號(hào)外顯子缺失突變）和1 例EGFRY112X突變（3號(hào)外顯子）。

圖1 EGFR外顯子19缺失是甲狀腺腫瘤患者中的一種潛在突變類型A：50 例各種類型的甲狀腺癌患者樣本癌種分布；B：甲狀腺癌中常見的驅(qū)動(dòng)基因及檢出情況。Fig.1 The deletion of EGFR exon 19 is a potential mutant type in thyroid-derived cancer patientsA: Distribrtion of cancer types of 50 samples of malignant thyroid carcinima; B: Detection of the common driver gene in thyroid cancer.

由于在我們的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)4%（2/50）的患者存在EGFR突變，且其中1 例為19號(hào)外顯子缺失突變，表明這并不是偶然事件。接下來，我們探究EGFR 19號(hào)外顯子缺失突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能特性。

2.2 HTFEC外顯子19缺失的細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng) 癌細(xì)胞進(jìn)行遷移和侵襲的能力是惡性腫瘤細(xì)胞的重要表型[10]，因此，我們檢測了EGFR外顯子19缺失突變對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在表皮生長因子（EGF）刺激下HTFEC-ex19 del組能夠以更快的速度愈合，并且遷移至Transwell小室底部的細(xì)胞數(shù)更多；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力，在EGF刺激下，HTFEC-ex19 del細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量顯著多于對(duì)照組。此外，使用一代EGFR TKI（Gefitinib）處理可顯著抑制HTFEC-ex19 del細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2A-C）。

圖2 HTFEC-ex19 del細(xì)胞的遷移侵襲能力增強(qiáng)A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，EGF（20 ng/mL），Gefitinib（50 nmol/L）（標(biāo)尺長度：50 μm）；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移侵襲能力，EGF（20 ng/mL），Gefitinib（50 nmol/L）（標(biāo)尺長度：50 μm）；C：圖A的統(tǒng)計(jì)圖，n＝3，**P＜0.01；D：圖B的統(tǒng)計(jì)圖，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。Fig.2 The abilities of migration and invasion in HTFEC-ex19 del cells were enhancedA: Cell migration ability was detected by Wound Healing. EGF (20 ng/mL), Gefitinib (50 nmol/L) (Scale length: 50 μm); B: The abilitise of migration and invasion were detected by Transwell. EGF (20 ng/mL), Gefitinib (50 nmol/L) (Scale length: 50μm); C:The statistical graph of Figure A. n＝3，**P＜0.01; D: The statistical graph of Figure B，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01.

以上結(jié)果表明，EGFR外顯子19缺失突變以EGF依賴性方式顯著誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，EGFR TKI可有效抑制這一現(xiàn)象。

2.3 GSEA富集分析EGFR外顯子19缺失突變?cè)诩谞钕贋V泡上皮細(xì)胞惡性行為中驅(qū)動(dòng)的分子通路 為了深入了解EGFR外顯子19缺失在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞促侵襲轉(zhuǎn)移中選擇性驅(qū)動(dòng)的分子通路，我們進(jìn)行了GSEA富集分析。富集分析發(fā)現(xiàn)，EGFR下游的PI3K-AKT-MTOR信號(hào)通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑、p53途徑致癌和KRAS途徑等在HTFEC-ex19 del細(xì)胞中顯著富集（圖3A-B）。大多數(shù)顯著上調(diào)的致癌基因，如與癌細(xì)胞侵襲行為有關(guān)的CCL5等在HTFEC-ex19 del組也被富集（圖3C）。另外，在HTFEC-ex19 del細(xì)胞中，RAS信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加、EGFR信號(hào)通路受體和配體的整體表達(dá)增加（圖3D-E）。接下來，我們檢查了EGFR下游兩條重要的信號(hào)通路變化，與GSEA富集分析結(jié)果一致的是，與對(duì)照組相比，在HTFEC-ex19 del細(xì)胞磷酸化AKT的表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖3F）。綜上，這提示我們EGFR外顯子19缺失突變可能是通過PI3K-AKT通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑、p53途徑致癌和KRAS來介導(dǎo)細(xì)胞的侵襲性行為。

圖3 EGFR外顯子19缺失后細(xì)胞中通過GSEA富集的信號(hào)通路A：GSEA富集的信號(hào)通路柱狀圖，橫坐標(biāo)為歸一化后的富集分?jǐn)?shù)（NES），縱軸為富集到的信號(hào)通路；B：GSEA富集通路圖，p53、KRAS途徑顯著富集；C：GSEA分析差異基因熱圖，紅色為在該組中表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色為表達(dá)下調(diào)；D，E：RAS，EGF/EGFR信號(hào)通路的關(guān)鍵配體和受體的基因表達(dá)的Log2FC變化值；F：Western Blot檢測磷酸化蛋白水平變化，EGF（20 ng/mL）。Fig.3 GSEA-enriched signaling pathways in EGFR exon 19 deletion cellsA: The histogram of GSEA-enriched signaling pathways. The abscissa is the normalized enrichment fraction (NES). The vertical axis shows the enriched signal pathways; B: The diagram of GSEA enrichment pathway. p53, KRAS pathway significantly enriched;C: Differential gene heat map were analyzed GSEA. Red indicates upregulation in this group, and blue indicates downregulation in this group; D, E: The change of Log2FC value of key ligands and receptors in the RAS and EGF/EGFR signaling pathway; F: The changes of phosphorylated protein levels were detected by Western Blot, EGF (20 ng/mL).

3 討論

對(duì)于甲狀腺癌，例如FTC、PDTC或ATC，治療相對(duì)困難[9]，因?yàn)橥ǔ?huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其是ATC發(fā)展迅速[11]。因此，了解腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)靶向治療甲狀腺癌尤為重要。有研究顯示，EGFR突變可能是PTC致癌轉(zhuǎn)化的主要遺傳改變之一[12]。另一項(xiàng)ATC研究顯示，EGFR擴(kuò)增可能與原發(fā)性甲狀腺癌的生物學(xué)去分化過程有關(guān)[13]。本研究中，我們證實(shí)了EGFR外顯子19缺失突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞獲得侵襲生長特性，然而對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)制尚不十分清楚。GSEA富集分析顯示在HTFEC-ex19 del細(xì)胞中PI3K-AKT、EMT、KRAS、p53等通路的激活。因此，我們考慮EGFR外顯子19缺失突變促使細(xì)胞發(fā)生侵襲性行為，是否與這些通路激活有關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。

我們對(duì)HTFEC和HTFEC-ex19 del細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)重要的途徑。除了上述結(jié)果所述外，我們還發(fā)現(xiàn)，EGFR外顯子19缺失后細(xì)胞具有免疫抑制特征，包括INF γ/α反應(yīng)、TNFα/NF-κB信號(hào)、缺氧和炎癥反應(yīng)。此外，癌癥相關(guān)信號(hào)通路也顯著富集，如hedgehog信號(hào)通路、糖酵解、有絲分裂紡錘體和活性氧途徑（圖3A）。這些通路是否也在EGFR外顯子19缺失突變促使細(xì)胞發(fā)生侵襲性行為中發(fā)揮重要作用，有待進(jìn)一步探索。

綜上，我們確定了顯著改變的通路，這些通路變化可能是EGFR外顯子19缺失突變發(fā)生侵襲性行為的主要途徑。鑒定和表征與這些通路相關(guān)的生物學(xué)功能，有助于深入了解具有EGFR外顯子19缺失突變的惡性甲狀腺腫瘤本身的生物學(xué)行為。同時(shí)，這些基因和通路可以用作潛在治療靶標(biāo)或生物標(biāo)志物，來區(qū)別診斷或判斷預(yù)后情況，為不同的治療方法組合提供有效選擇。