間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血液中抗西尼羅河病毒單克隆抗體MlL94濃度及其應(yīng)用

相亞楠，王靈超，高 尤，羅龍龍，張文鵬，莊笑梅

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）屬于黃病毒科黃病毒屬的B群蟲(chóng)媒病毒，病毒成球形，直徑約50 nm，為單層囊膜結(jié)構(gòu)，囊膜上有一層薄層突起，呈棒狀結(jié)構(gòu)［1-3］。WNV全基因組由約11 kb核苷酸組成，屬不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒［4］。WNV于1937年在西尼羅河地區(qū)一位發(fā)熱的成年婦女血液中分離得到，因此命名為西尼羅河病毒［5］。西尼羅河熱（West Nile fever，WNF）是由WNV引起的一種人畜共患病，主要經(jīng)蚊傳播，可導(dǎo)致人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡，也可引起馬、禽類和貓等動(dòng)物發(fā)?。?］。

WNV病在非洲、中東、西部及中部亞洲、大洋洲和歐洲部分地區(qū)廣泛流行，自1999年起首次在北美洲大面積流行。最近，先后于1994年在阿爾及利亞、1996-1997年在羅馬尼亞、1999-2002年在美國(guó)發(fā)生WNV病導(dǎo)致的腦炎病例［7-9］。目前我國(guó)尚無(wú)WNV病發(fā)病的報(bào)道。隨著國(guó)際交流增多、商貿(mào)交易頻繁以及鳥(niǎo)類遷徙，該病有傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須高度警惕WNF在國(guó)內(nèi)的傳播。

目前尚無(wú)批準(zhǔn)上市的疫苗及藥物用于人感染W(wǎng)NV的預(yù)防和治療。2003年，美國(guó)批準(zhǔn)馬用甲醛溶液滅活WNV疫苗上市，其保護(hù)效率可達(dá)94%，但必須每年加強(qiáng)注射［10］。與疫苗需要提前注射相比，抗體藥物用于感染后治療，受試人群縮小，節(jié)約了人力、物力和財(cái)力，因此開(kāi)發(fā)抗WNV治療性抗體迫在眉睫。迄今已有數(shù)個(gè)單抗藥物進(jìn)入非臨床研究（如CR4348和CR4354）以及臨床Ⅱ期試驗(yàn)（如hE16和pE16），但其最終能否被批準(zhǔn)用于臨床治療仍面臨許多挑戰(zhàn)［11］。MIL94是由軍事醫(yī)學(xué)研究院研究的抗WNV全人源單抗，該抗體是由CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生，具有免疫原性低、不受季節(jié)影響、生產(chǎn)力高等優(yōu)勢(shì)。前期小鼠染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能全保護(hù)（數(shù)據(jù)未公開(kāi)），正在進(jìn)行系統(tǒng)非臨床藥動(dòng)學(xué)研究。

本研究擬優(yōu)化建立一種特異、靈敏的定量檢測(cè)食蟹猴血清中MIL94濃度的間接ELISA，經(jīng)全面驗(yàn)證后，進(jìn)行食蟹猴體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的初步研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

普通級(jí)食蟹猴12只，北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0011；年齡3～4歲，體重2.5～3.5 kg，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由取食、飲水，食蟹猴接受的所有操作均符合本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定（IACUC-DWZX-2020-627）。

MIL94標(biāo)準(zhǔn)品（7.2 g·L-1，批號(hào)：190410，軍事醫(yī)學(xué)研究院）；食蟹猴空白血清（批號(hào)：20190928，北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司）；抗原：envelope protein（domain Ⅲ，His Tag）（貨號(hào)：40345-V08Y，美國(guó)Sino Biological公司）；二抗：辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗人IgG（貨號(hào)：SE101，北京Solarbio公司）；TMB顯色液（貨號(hào)：00-4201-56，美國(guó)invitrogen公司）；洗滌液PBST溶液（含0.05% Tween 20的PBS（自行配置）；pH 7.4 PBS（貨號(hào)：C10010500BT，美國(guó)Gibco公司）；酪蛋白封閉液（貨號(hào)：C5890，美國(guó)Sigma公司）；氮化鈉注射液（批號(hào)：2006103205，石家莊四藥有限公司）。

SPECTRO starNano型酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG LABTECH公司）；微量加樣器（美國(guó)Eppendorf公司）；離心機(jī)和96孔板（美國(guó)Thermo公司）；微量振蕩器（廣州SCILOGEX公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；洗板機(jī)（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開(kāi)發(fā)中心）；促凝采血管（美國(guó)BD公司，添加SST Amber高分子凝膠促凝）。

1.2 間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELlSA）

①包被：用包被緩沖液將WNV抗原稀釋到1 mg·L-1，于酶標(biāo)板中每孔加100 μL包被，4℃包被過(guò)夜。②洗滌：用洗板機(jī)反復(fù)洗板5次，拍干。③封閉：每孔加200 μL酪蛋白封閉液，37℃孵育1 h。④洗滌：用洗板機(jī)反復(fù)洗板5次，拍干。⑤加樣品：用空白食蟹猴血清稀釋系列濃度（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1）的MIL94制備成標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，同法配制0.5，1.6和25 mg·L-1MIL94質(zhì)控樣品，每孔加100 μL，每個(gè)樣品平行做2孔，37℃孵育2 h。⑥洗滌：用洗板機(jī)洗板5次，拍干。⑦酶標(biāo)抗體：用二抗稀釋液按1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗人IgG，每孔加100 μL，37℃避光孵育1 h。⑧ 洗滌：用洗板機(jī)反復(fù)洗板5次，拍干。⑨顯色：每孔加100 μL TMB顯色液，室溫避光放置10 min。⑩ 終止：每孔加100 μL 2N H2SO4終止液終止反應(yīng)。?測(cè)定：酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A450nm）。

數(shù)據(jù)處理：將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度值（X）與所測(cè)定的吸光值（Y）利用SPECTRO starNano軟件的四參數(shù)法進(jìn)行擬合，根據(jù)得到的四參數(shù)方程式計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。四參數(shù)擬合方程為：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope）。其中Top為擬合曲線的上端漸進(jìn)線的估計(jì)值（A值），Bottom為擬合曲線的下端漸進(jìn)線的估計(jì)值（A值），Slope為校正曲線的斜率，X為實(shí)測(cè)濃度，EC50為50%吸光度值對(duì)應(yīng)的樣品濃度，通過(guò)擬合最優(yōu)的曲線作為校正曲線。

方法學(xué)驗(yàn)證：按生物樣品臨床前藥動(dòng)學(xué)指導(dǎo)原則要求，進(jìn)行了特異性、精密度和準(zhǔn)確度、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、平行性選擇性和穩(wěn)定性等全面驗(yàn)證。

1.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

給藥方案：12只食蟹猴隨機(jī)分為2組，每組6只，雌雄各半給藥劑量為5和100 mg·kg-1。給藥量按食蟹猴體重計(jì)算，推注前用注射用生理鹽水將MIL94稀釋至所需濃度，控制推注速度確保食蟹猴在30 min內(nèi)推注完畢。

血清樣品的制備：給藥前采集食蟹猴空白血，并分別于給藥開(kāi)始后5 min、給藥結(jié)束即刻、給藥開(kāi)始后1，2，4，8，24 h，3，5，7，10，14，21，28，35，42，49，56和63 d于頭靜脈采血，每次采血量約1 mL，置促凝離心管中。全部血樣均于室溫凝固30 min后，4℃，2500×g離心10 min獲得血清，分裝后于-40℃凍存，待測(cè)。

數(shù)據(jù)處理：用WinNonlin軟件，按非房室統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算靜脈推注給藥后食蟹猴的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：曲線下面積（area under curve，AUC），清除率（clearance，Cl），穩(wěn)態(tài)表觀分布容積（steady state apparent distribution volume，Vss），消除半衰期（half life，t1/2）和平均駐留時(shí)間（mean residence time，MRT）。采用 Microsoft EXCEL（2010）計(jì)算均值，使用GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果

2.1 食蟹猴血清中MlL94 ELlSA方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定濃度為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，0.125和64 mg·L-1作為錨定點(diǎn)，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。結(jié)果表明，MIL94在0.25～32 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度的對(duì)數(shù)值與A值呈S形曲線（圖1）。

Fig.1 Standard curve of MlL94 in cynomolgus monkey serum sample obtained by four parameters fitting method.The logarithmic concentration value of the standard curve is an S-shaped curve with the response value.The standard curve ranges in concentration 0.125-64 mg·L-1.The fourparameter fitting equation is：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope），r2＞0.99.Top is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the upper end of the fitting curve.Bottom is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the lower end of the fitting curve.Slope is the slope of the correction curve.X is the measured concentration.EC50is the sample concentration corresponding to 50% light absorption value，and the optimal fitting curve is used as the correction curve.

2.1.2 特異性

采用該ELISA考察人IgG與WNV抗原包被板的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，人IgG與MIL94不存在交叉反應(yīng)，食蟹猴血清基本無(wú)反應(yīng)本底（表1）。

Tab.1 Concentration of MlL94 measured after adding different doses of human-lgG

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度

按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成MIL94 0.5，1.6和25 mg·L-1的質(zhì)控樣品，通過(guò)建立的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算板間與板內(nèi)的精密度，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出各濃度MIL94的檢出量。準(zhǔn)確度范圍分別為板內(nèi)105.4%～108.1%，板間98.0%～106.9%；精密度分別為板內(nèi)1.18%～4.62%，板間8.19%～10.2%。均符合生物樣品分析方法驗(yàn)證M10中的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accuracy of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.4 稀釋線性和鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）

由于MIL94在食蟹猴體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中給藥劑量較大，實(shí)際血清樣品濃度較高，超出了標(biāo)曲定量范圍，需要進(jìn)行稀釋，因此對(duì)血清樣品的稀釋準(zhǔn)確度進(jìn)行考察。而抗體濃度過(guò)高時(shí)可能出現(xiàn)抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性現(xiàn)象，因此需要考察鉤狀效應(yīng)［12］。用食蟹猴混合空白血清分別稀釋3個(gè)MIL94高濃度樣本（1000，2000和4000 mg·L-1）作為鉤狀效應(yīng)樣本，然后分別稀釋1000，2000和4000倍至1 mg·L-1作為稀釋線性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。鉤狀效應(yīng)樣本最高濃度選擇4000 mg·L-1是因?yàn)榇藵舛扰cMIL94食蟹猴高劑量給藥時(shí)體內(nèi)血藥濃度一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋線性滿足要求，鉤狀效應(yīng)樣本的A值與標(biāo)曲高點(diǎn)響應(yīng)一致，該劑量下無(wú)明顯的鉤狀效應(yīng)（表3）。

Tab.3 Linear dilution of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.5 平行性

平行性考察不同的稀釋倍數(shù)是否對(duì)測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。選取3個(gè)真實(shí)樣本，用空白食蟹猴混合血清將3個(gè)樣本分別稀釋不同倍數(shù)（1000，2000和5000倍）至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。結(jié)果表明，3個(gè)樣本的RSD（%）介于7.4%～16.9%，在最高稀釋倍數(shù)（5000倍）下，不會(huì)對(duì)樣品的準(zhǔn)確度造成影響。

2.1.6 選擇性

準(zhǔn)備10個(gè)單只食蟹猴空白血清樣本，每個(gè)血清樣本制備1個(gè)空白樣本，1個(gè)定量下限樣本（low limit of detection，LLOQ），1個(gè)高濃度質(zhì)控樣本（high concentration quality control，HQC）。結(jié)果表明，10個(gè)空白食蟹猴血清樣本回算濃度均低于LLOQ，MIL94的LLOQ與HQC的血清樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確度分別介于96.8%～118.8和99.13%～116.59%之間，滿足生物樣品驗(yàn)證指導(dǎo)原則M10的要求。

2.1.7 穩(wěn)定性

低濃度質(zhì)控（low concentration quality control，LQC），HQC的樣本配制即刻（C0），常溫放置4 h，-40℃放置7，14和28 d及反復(fù)凍融3次和5次后（每個(gè)濃度水平3個(gè)樣本）測(cè)定，樣品凍存至28 d穩(wěn)定，可用于食蟹猴靜脈推注MIL94后藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)（表4和表5）。

Tab.4 Short-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

Tab.5 Long-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

2.2 單次靜注不同劑量MlL94后食蟹猴體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征

單次靜注不同劑量后MIL94在食蟹猴體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。用WinNonlin軟件，按非房室統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算靜脈給藥后食蟹猴的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表6）。結(jié)果提示，MIL94食蟹猴靜推給藥后，兩劑量組間t1/2、Vss、MRT較為接近，體內(nèi)暴露量AUC與給藥劑量基本成線性，Vss與食蟹猴血清容量一致，說(shuō)明MIL94主要分布在血液中MRT較長(zhǎng)，在10 d以上。

Fig.2 Mean serum concentration-time curves of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected.Four cynomolgus monkeys were randomly divided into 2 groups with 2 monkeys in each and the drug doses were 5 and 100 mg·kg-1.The dosage was calculated according to the body mass of the cynomolgus monkeys.The route of administration was intravenous injection（IV）.MIL94 was diluted to the required concentration with 0.9% normal saline before infusion，and the infusion speed was controlled to ensure that the cynomolgus monkeys were injected within 30 minutes.The X axis represents the time of blood collection，and the Y axis represents the serum drug concentration.x±s，n=6.

Tab.6 Main pharmacokinetic parameters of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected

3 討論

本研究建立的間接ELISA檢測(cè)方法的定量下限0.25 mg·L-1，線性范圍達(dá)＞125倍。方法開(kāi)發(fā)時(shí)有3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：①洗滌緩沖液篩選了PBS和含不同比例Tween 20的PBS，結(jié)果表明洗滌緩沖液（PBST）中添加0.05%表面活性劑Tween 20時(shí)洗脫能力最好；②單一成分的封閉液無(wú)法達(dá)到完全封閉的效果，嘗試了BSA、酪蛋白、脫脂奶粉等蛋白進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇10%脫脂奶粉作為封閉液，稀釋液體積比為PBS∶PBST∶酪蛋白=2∶1∶1；③ 方法建立后先考察特異性，確證本法能排除相關(guān)基質(zhì)干擾，再進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度等考察。通過(guò)對(duì)以上關(guān)鍵點(diǎn)的優(yōu)化，結(jié)果表明，建立的食蟹猴血清中MIL94的間接ELISA檢測(cè)方法在特異性、準(zhǔn)確度、精密度、稀釋線性和穩(wěn)定性等方面均符合生物樣品分析指導(dǎo)原則M10［13］的要求，可用于食蟹猴血清MIL94的定量檢測(cè)。

單抗藥物在體內(nèi)的分布和清除過(guò)程與新生兒Fc受 體（Neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）密 切 相關(guān)［14-16］，而FcRn與單抗的結(jié)合具有種屬特異性。由于MIL94是全人源化單抗，通過(guò)與人體hFcRn特異結(jié)合而介導(dǎo)其組織分布和轉(zhuǎn)運(yùn)。在非臨床研究階段，由于物種差異，動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征很難外推到臨床。從動(dòng)物種屬來(lái)說(shuō)，非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類的遺傳物質(zhì)有75%～98.5%同源性［17-18］，是最接近人的物種。因此，采用食蟹猴進(jìn)行臨床前藥動(dòng)學(xué)研究意義極大。

食蟹猴靜注MIL94 5和100 mg·kg-1后，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征顯示，在5～100 mg·kg-1給藥劑量范圍內(nèi)，AUC與給藥劑量基本成比例；Cl很低，且不隨給藥劑量改變；末端t1/2＞10 d。Vss也不隨給藥劑量改變，且與食蟹猴血容量相當(dāng)（45 mL·kg-1）［19-20］，提示MIL94作為大分子類單抗藥物，難以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入組織，主要在循環(huán)血液中分布，其分布和排泄特征正在大鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。

綜上，本研究建立的間接ELISA測(cè)定食蟹猴血清中MIL94濃度的方法滿足非臨床藥動(dòng)學(xué)研究需求，并初步獲得了MIL94在食蟹猴中線性暴露和消除的藥動(dòng)學(xué)特征，為MIL94的非臨床及臨床藥動(dòng)學(xué)系統(tǒng)研究提供了支持。