在大鼠藥物辨別和小鼠催促戒斷模型上評價(jià)右美托咪定的依賴性潛能

李 亮，曹福羊，田 冶，陳 瑛

（1.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心麻醉科，北京 100048；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

右美托咪啶（dexmedetomidine，DEX）是一種新型高選擇性α2腎上腺素受體（α2-adrenergic receptor，α2-AR）激動劑，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮和鎮(zhèn)痛作用［1］。在嚙齒動物和人類中，DEX通過激活中樞藍(lán)斑突觸前和突觸后α2-AR產(chǎn)生近似自然睡眠的鎮(zhèn)靜作用，對呼吸功能的抑制作用較小，其獨(dú)特之處在于患者易于喚醒與合作［2-3］。目前有研究表明，DEX具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可減少細(xì)胞凋亡［4-7］。此外，DEX對心、肺和腎等具有一定保護(hù)作用［8-9］。因其獨(dú)特的藥理特點(diǎn)，DEX廣泛應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)和維持、ICU插管鎮(zhèn)靜、程序性鎮(zhèn)靜和術(shù)后鎮(zhèn)痛。然而，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，特別是鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥，自身可能存在濫用或成癮的隱患，對藥物的依賴性潛能進(jìn)行有效評估是臨床安全用藥的基石。

此前研究表明，DEX在大鼠條件性位置偏愛模型上表現(xiàn)出精神依賴潛能［10］，但在大鼠藥物辨別模型上的精神依賴評價(jià)和小鼠催促戒斷模型上的軀體依賴評價(jià)尚未見報(bào)道。藥物辨別模型是一種研究藥物辨別刺激性質(zhì)的行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，目前已廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的精神依賴評價(jià)中，該模型提供了一種研究藥物急性藥理作用對動物內(nèi)在體驗(yàn)反應(yīng)的方法［11］。催促戒斷模型是一種評價(jià)藥物軀體依賴潛能的經(jīng)典方法，具有實(shí)驗(yàn)周期短、戒斷癥狀發(fā)作快、持續(xù)時(shí)間短、操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)［12］。阿片類藥物具有不同程度的依賴性潛力［13］。因此，本研究采用阿片受體激動劑嗎啡作為建模陽性藥物，在上述2個經(jīng)典依賴模型上進(jìn)一步評價(jià)DEX的依賴潛力，為藥物的臨床安全應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只清潔級雄性SD大鼠，初始體重220～250 g，實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期間限食限水飼養(yǎng)，使大鼠體重控制在300～350 g，其余時(shí)間自由攝食及飲水。60只清潔級KM小鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重16～33 g，正常喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。2個種屬動物均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房，12 h/12 h晝夜自然光照，通風(fēng)良好，室溫20～26℃，濕度40%～60%。本研究實(shí)驗(yàn)動物的使用（動物數(shù)量、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及對動物的處理）均遵循本單位實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥品

DEX注射液（200 μg·mL-1，恒瑞制藥有限公司，批號：190222BP）；嗎啡鹽酸注射液（10 mg·mL-1，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號：180906-1）；納洛酮鹽酸注射液（0.4 mg·mL-1，北京凱因科技股份有限公司，批號：05190301），生理鹽水（normal saline，NS）河北天成藥業(yè)股份有限公司。DEX、嗎啡和納洛酮均于臨用前用NS稀釋至所需濃度。

1.3 儀器

AES-DSA20大鼠操作行為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（安來科學(xué)儀器有限公司）。整個實(shí)驗(yàn)裝置由大鼠操作行為箱和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)組成。大鼠操作行為箱中配有左右鼻觸，鼻觸燈、籠燈和食物槽，若大鼠鼻觸反應(yīng)正確，則籠燈滅，鼻觸燈亮，此時(shí)大鼠可從食物槽中獲得糖水。實(shí)驗(yàn)過程由計(jì)算機(jī)自動控制完成。

1.4 大鼠藥物辨別實(shí)驗(yàn)［14-15］

1.4.1 食物訓(xùn)練期

訓(xùn)練開始時(shí)采用固定比率（fixed ratio，F(xiàn)R）1（即鼻觸響應(yīng)1次就能得到1次糖水強(qiáng)化），若大鼠在同一程序下連續(xù)2 d在30 min內(nèi)獲得100次糖水，則FR值增加1次，要求大鼠依次完成FR1～FR10的訓(xùn)練。左右鼻觸均為有效鼻觸。

1.4.2 辨別訓(xùn)練期

完成食物訓(xùn)練的大鼠進(jìn)入藥物（嗎啡或NS）辨別訓(xùn)練期。采用重復(fù)交替訓(xùn)練法，首先給予2 d嗎啡訓(xùn)練，隨后2 d給予NS訓(xùn)練，之后依次循環(huán)，以4個實(shí)驗(yàn)期為1個訓(xùn)練周期，每個實(shí)驗(yàn)期30 min。每個實(shí)驗(yàn)期前25 min sc給予嗎啡2.5 mg·kg-1或等容積的NS，訓(xùn)練時(shí)指定操作箱內(nèi)右鼻觸為嗎啡鼻觸，左鼻觸為NS鼻觸。設(shè)定給嗎啡時(shí)嗎啡鼻觸為有效鼻觸，給NS時(shí)NS鼻觸為有效鼻觸。訓(xùn)練開始時(shí)FR1，即有效鼻觸響應(yīng)1次就能得到1次糖水強(qiáng)化，鼻觸響應(yīng)時(shí)鼻觸燈亮，以大鼠在1個訓(xùn)練周期內(nèi)反應(yīng)正確率≥80%為合格。若大鼠達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，則FR值增加1次，F(xiàn)R值依次遞增至FR10，記錄大鼠的反應(yīng)正確率。若FR值增加后，大鼠未達(dá)到訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)，可通過增加訓(xùn)練周期或降低FR值重新訓(xùn)練，直到合格為止。當(dāng)FR值增至10，大鼠連續(xù)2個訓(xùn)練周期反應(yīng)正確率≥80%時(shí)，進(jìn)行嗎啡辨別測試。測試期前25 min sc給予相同訓(xùn)練劑量的嗎啡或等容積的NS。測試期間，兩鼻觸均為有效鼻觸，大鼠在任一鼻觸上完成固定比率FR10都能得到糖水。若大鼠鼻觸反應(yīng)正確率≥80%，則表明大鼠能夠辨別嗎啡及NS，否則，仍進(jìn)行訓(xùn)練期。

1.4.3 替代期

（1）嗎啡替代：當(dāng)大鼠在FR10程序下能夠穩(wěn)定辨別嗎啡及NS后，分別sc給予嗎啡0.3125，0.625，1，1.25和2.5 mg·kg-1進(jìn)行替代實(shí)驗(yàn)。大鼠給予嗎啡一個劑量測試完成后，重新FR10訓(xùn)練，待恢復(fù)基線值后進(jìn)行下一個劑量測試，在替代實(shí)驗(yàn)期，兩鼻觸均指定為有效鼻觸，記錄大鼠鼻觸反應(yīng)的正確率，并與訓(xùn)練劑量下的辨別效應(yīng)進(jìn)行比較。

（2）DEX替代：嗎啡替代實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠繼續(xù)用嗎啡和NS在FR10程序下進(jìn)行辨別訓(xùn)練，直至恢復(fù)基線值（嗎啡測試后大鼠鼻觸正確率≥80%），分別ip給予NS和DEX 5，10，20 μg·kg-115 min后放入操作箱中進(jìn)行替代實(shí)驗(yàn)。記錄大鼠鼻觸反應(yīng)的正確率，并與嗎啡的辨別效應(yīng)進(jìn)行比較。在替代實(shí)驗(yàn)期，兩鼻觸均指定為有效鼻觸。

1.5 小鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)［16-17］

實(shí)驗(yàn)設(shè)DEX 5，20和40 μg·kg-1組，同時(shí)設(shè)NS組和嗎啡組。每組12只小鼠，雌、雄各半。嗎啡組遞增劑量給予嗎啡，依次為30，40，50，60和70 mg·kg-1，每天sc給藥3次，即每日劑量依次為90，120，150，180和 210 mg·kg-1，連續(xù)給藥 5 d；DEX 3個組恒定劑量分別每日ip給予DEX 5，20和40 μg·kg-1，連續(xù)給藥 5 d，每天 2次；對照組連續(xù)5 d ip給予NS，10 mL·kg-1，每天2次。于末次給藥6 h內(nèi)，ip給予納洛酮8 mg·kg-1進(jìn)行催促戒斷，觀察納洛酮催促30 min內(nèi)小鼠的戒斷跳躍次數(shù)及納洛酮給藥前后1 h小鼠體重的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠藥物辨別實(shí)驗(yàn)

2.1.1 大鼠嗎啡辨別模型的建立

大鼠經(jīng)過12～27個訓(xùn)練周期均能夠在FR10程序下辨別嗎啡2.5 mg·kg-1和NS，即注射嗎啡時(shí)選擇嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率≥80%，注射NS選擇NS鼻觸反應(yīng)正確率≥80%。在嗎啡測試期，大鼠對嗎啡的鼻觸反應(yīng)正確率為（98.8±2.6）%，在NS測試期，大鼠對嗎啡的鼻觸反應(yīng)正確率為（0.4±0.7）%（圖1）。

2.1.2 不同劑量嗎啡對辨別刺激效應(yīng)的影響

對已形成嗎啡辨別的大鼠，分別以嗎啡0.3125，0.625，1，1.25和2.5 mg·kg-1替代訓(xùn)練劑量的嗎啡。結(jié)果顯示，不同劑量嗎啡替代組的嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率分別為（4.4±14.6）%，（15.7±33.6）%，（42.1±43.6）%，（63.2±36.5）%和（93.0±23.4）%（圖1），嗎啡產(chǎn)生的辨別刺激效應(yīng)呈劑量依賴性增長，當(dāng)嗎啡劑量等于訓(xùn)練劑量2.5 mg·kg-1時(shí)，大鼠嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率≥80%。當(dāng)注射NS時(shí)，嗎啡應(yīng)答反應(yīng)近乎零。嗎啡0.3125和0.625 mg·kg-1劑量組不能替代嗎啡2.5 mg·kg-1的辨別效能，嗎啡1和1.25 mg·kg-1劑量組能部分替代嗎啡2.5 mg·kg-1的辨別效能；劑量對數(shù)-反應(yīng)正確率回歸曲線擬合嗎啡辨別ED50對應(yīng)的劑量為1.089 mg·kg-1。

Fig.1 Drug-appropriate responding percentage in rats trained to discriminate morphine（Mor）2.5 mg·kg-1 from normal saline（NS）.Rats were trained under a fixedratio（FR）10-response schedule to discriminate Mor（2.5 mg·kg-1）from NS.Under this schedule，10 consecutive responses on one of the two nosepokes were reinforced with food presentation after a pre-session sc injection of Mor 2.5 mg·kg-1，and 10 consecutive responses on the alternative nosepoke were reinforced after NS sc injection.When daily performances were stable，substitution patterns for a range of doses of Mor（0.3125，0.625，1，1.25 and 2.5 mg·kg-1）were assessed during test sessions in which 10 consecutive responses on either nosepoke were reinforced.±s，n=18.

2.1.3 不同劑量DEX替代嗎啡效應(yīng)的影響

圖2結(jié)果顯示，分別ip給予NS或DEX 5，10和20 μg·kg-1進(jìn)行替代實(shí)驗(yàn)。溶劑和不同劑量DEX替代組的嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率分別為（1.0±1.6）%，（2.1±6.2）%，（1.2±1.4）%和（1.8±2.6）%，反應(yīng)正確率均低于20%（圖2），表明DEX不能替代嗎啡2.5 mg·kg-1。

Fig.2 Drug-appropriate responding percentage in rats trained to discriminate Mor 2.5 mg·kg-1from NS across various doses of dexmedetomidine（DEX）and NS.See Fig.1 for the rat treatment.When daily performances were stable，substitution patterns for a range of doses of DEX（5，10 and 20 μg·kg-1）were assessed during test sessions in which 10 consecutive responses on either nosepoke were reinforced.25 min after Mor and NS were sc given，or 15 min after DEX was ip given，the rats were tested.±s，n=18.

2.2 小鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)

2.2.1 DEX對納絡(luò)酮催促小鼠跳躍次數(shù)的影響

與NS組相比，嗎啡組小鼠30 min內(nèi)的戒斷跳躍次數(shù)（25.9±22.3）次，顯著高于溶劑對照組（0.1±0.3）次（P＜0.01），表明嗎啡亞急性給藥誘發(fā)小鼠形成了軀體依賴；每日ip給予DEX 5，20和40 μg·kg-1的小鼠在納洛酮催促30 min內(nèi)的戒斷跳躍次數(shù)分別為0.1±0.3，0.0±0.0和（0.0±0.0）次與NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

Fig.3 Effect of DEX on number of jumps in precipated withdrawal test in mice.The mice were ip given DEX 5，10 and 20 μg·kg-1·d-1for 5 consecutived days or sc given Mor at the increasing doses of 90，120，150，180 and 210 mg·kg-1·d-1 or NS for 5 consecutived days.Mice were ip injected naloxone at the dose of 8 mg·kg-1within 6 h after the last administration.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with NS group.

2.2.2 DEX對納絡(luò)酮催促小鼠體重變化的影響

與NS組相比，嗎啡組小鼠給藥前后1 h的體重變化（1.6±0.6）g顯著高于NS組（0.7±0.6）g（P＜0.01），表明嗎啡亞急性給藥誘發(fā)小鼠形成了軀體依賴；每日ip給予DEX 5，20和40 μg·kg-1組小鼠納洛酮給藥前后1 h體重變化分別為0.7±0.5，0.8±0.4和（1.0±0.6）g，與溶劑對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.4 Effect of DEX on change of body mass in precipated withdrawal test in mice.See Fig.3 for the mouse treatment.Change of body weight（g）=body weight before naloxone precipation（g）-body weight at 1 h after naloxone precipation（g）.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with NS group.

3 討論

目前國內(nèi)外評價(jià)藥物依賴性潛能的動物模型通常包括2大類，即精神依賴實(shí)驗(yàn)和軀體依賴實(shí)驗(yàn)。評價(jià)藥物是否具有依賴性應(yīng)結(jié)合精神依賴和軀體依賴模型。精神依賴模型包括條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)、自身給藥實(shí)驗(yàn)和藥物辨別實(shí)驗(yàn)，軀體依賴模型包括自然戒斷實(shí)驗(yàn)和催促戒斷實(shí)驗(yàn)［18-19］。本研究選擇大鼠藥物辨別實(shí)驗(yàn)和小鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)評價(jià)DEX的依賴性潛能，以阿片類鎮(zhèn)痛藥物之一嗎啡作為陽性對照藥。嗎啡成癮主要與腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)密切相關(guān)，通過與γ-氨基丁酸能神經(jīng)元上的μ受體結(jié)合，抑制其活性，解除它對多巴胺能神經(jīng)元的抑制作用，導(dǎo)致多巴胺釋放增多，產(chǎn)生獎賞效應(yīng)［20］。藥物辨別模型能夠模擬人類藥物濫用的行為，其原理基于依賴性藥物使人產(chǎn)生如欣快、滿足感等情緒主觀性效應(yīng)，具有主觀性效應(yīng)的藥物可以控制動物的行為反應(yīng)，使之產(chǎn)生辨別行為效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠可以建立嗎啡辨別刺激效應(yīng)，這些結(jié)果與先前的報(bào)道結(jié)果是一致的，嗎啡辨別效應(yīng)的劑量反應(yīng)曲線也是類似［21］。在嗎啡應(yīng)答反應(yīng)中，大鼠嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率呈劑量依賴性增長，并在嗎啡劑量等于訓(xùn)練濃度時(shí)，大鼠嗎啡鼻觸反應(yīng)正確率＞80%。在大鼠嗎啡辨別行為形成后的整個實(shí)驗(yàn)過程中，其反應(yīng)基線值保持穩(wěn)定，提示嗎啡的主觀感受沒有表現(xiàn)出耐受現(xiàn)象。表明本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠嗎啡辨別模型穩(wěn)定可靠，可用于評價(jià)DEX的精神依賴潛能。藥物辨別實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)鼻觸反應(yīng)正確率將替代藥物與訓(xùn)練藥物的辨別刺激性質(zhì)的相似程度劃分為3類，即藥理性質(zhì)與訓(xùn)練藥物極其相似（＞80%）、中度相似（20%～80%）和不同（＜20%）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEX（5，10，20 μg·kg-1）對嗎啡的辨別效應(yīng)均不產(chǎn)生替代作用，提示在大鼠藥物辨別模型上DEX不會泛化嗎啡，不具有類似嗎啡的辨別刺激效應(yīng)。與文獻(xiàn)報(bào)道［10］測試劑量（不抑制動物自發(fā)活動劑量，不會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果）的DEX在大鼠條件性位置偏愛模型上表現(xiàn)出精神依賴潛能的結(jié)果不一致，原因推測為2個模型的特點(diǎn)不同，條件性位置偏愛模型是非操作式的實(shí)驗(yàn)方法，將藥物的獎賞效應(yīng)作為非條件性刺激與伴藥箱（條件刺激）聯(lián)系起來，反映藥物的正性強(qiáng)化作用，而藥物辨別模型是操作式的實(shí)驗(yàn)方法，主要考察不同藥物之間的“主觀”用藥感受相似性，可進(jìn)行劑量關(guān)系比較從而定量地說明藥物精神依賴性潛力的強(qiáng)度。因此，精神依賴性是機(jī)體對藥物內(nèi)在感知的綜合體現(xiàn)，如滿足、欣快感，很難用一種適宜的動物模型來體現(xiàn)，需要采用多種模型來綜合評價(jià)。

催促戒斷是指動物短時(shí)間內(nèi)對藥物形成依賴后，用拮抗劑催促誘導(dǎo)戒斷癥狀的發(fā)生，觀察動物的戒斷癥狀并進(jìn)行體重的測定，通?？捎^察到的典型催促戒斷癥狀有跳躍、扭體、濕狗樣抖動、齒顫、理毛、抓臉、上瞼下垂、前爪震顫、腹瀉等植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及體重下降、體溫降低等。在這諸多催促戒斷癥狀中，戒斷性跳躍和體重下降被認(rèn)為是反映戒斷癥狀強(qiáng)度的最敏感、最可靠的指標(biāo)［22-23］。在軀體依賴實(shí)驗(yàn)中，本研究建立了嗎啡依賴小鼠催促戒斷模型，發(fā)現(xiàn)DEX每日5，20和40 μg·kg-1連續(xù)給藥5 d后給予阿片受體拮抗劑納絡(luò)酮催促后30 min內(nèi)幾乎無戒斷跳躍行為的發(fā)生，且納洛酮給藥前后1 h的體重變化與溶劑對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示DEX在小鼠催促戒斷模型上無致軀體依賴潛能。

綜上，DEX在大鼠藥物辨別模型和小鼠催促戒斷模型上未表現(xiàn)出依賴性潛能。