生脈飲聯(lián)合順鉑對氣陰兩虛型肺癌荷瘤小鼠抗腫瘤作用的研究

趙星雨， 李囿松

1.山西中醫(yī)藥大學研究生院，山西 太原 030024；2.山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)學科學院中醫(yī)科，山西 太原 030032

據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計報告估計，2018年全球新增癌癥病例1810萬，960萬人因癌癥死亡[1]。國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國新增癌癥病例392.9萬，并有233.8萬人因癌癥死亡，其中肺癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均居惡性腫瘤第1位[2]。據(jù)估計，世界范圍內(nèi)每年肺癌新發(fā)病例約有180萬，死亡病例約為160萬，其中中國的新增病例占35.8%，死亡病例占37.6%[3]，肺癌是我國人群中最常見的癌癥之一，也是導致癌癥死亡的首要原因。肺癌預(yù)后不良，在中國5年生存率僅為16.1%[4]，而且80%的初診肺癌病例為晚期，確診后的肺癌患者5年生存率低于15%[5]。肺癌不僅嚴重影響患者的生命質(zhì)量，而且對患者家屬及社會也是極大的消耗，找到切實有效的治療方法提高肺癌患者的生存率及生命質(zhì)量意義重大。

目前，肺癌常用的化療方案為以鉑類為基礎(chǔ)的方案，如GP方案(順鉑或卡鉑聯(lián)合吉西他濱）、TP方案(順鉑或卡鉑聯(lián)合紫杉醇）或EP(依托泊苷聯(lián)合順鉑）等治療方案。順鉑自20世紀70年代用于臨床以來，因其抗瘤譜廣，對多種惡性腫瘤及許多以往不敏感的難治性腫瘤有效，而且與既往常用的抗癌藥如烷化劑和抗代謝藥等無交叉耐藥，被認為是有效的化療藥，被廣泛應(yīng)用于臨床，成為當前最常用的抗癌藥物之一。但由于鉑類藥物在使用中常常會出現(xiàn)嚴重的副作用，如胃腸道反應(yīng)(嘔吐、腹瀉或便秘等）、腎毒性、骨髓抑制和免疫力低下的情況，高昂的治療費用以及難以忍受的副作用使患者難以長期堅持治療，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，采用化療藥物聯(lián)合中藥制劑治療肺癌，能取得增效減毒之功效，治療效果確切[6]。

中醫(yī)學對癌病的研究由來已久，遠在殷墟甲骨文就有“瘤”的記載，中醫(yī)認為癌瘤的發(fā)生多由于正氣內(nèi)虛、感受邪毒、情志怫郁、飲食損傷、素有舊疾等因素，使臟腑功能失調(diào)，氣血津液運行失常，產(chǎn)生氣滯、血瘀、痰凝、濕濁、熱毒等病理變化蘊結(jié)于臟腑組織，相互搏結(jié)，日久漸積而成的一類惡性疾病。中晚期由于癌瘤耗傷人體氣血津液，故多出現(xiàn)氣血虧虛、陰陽兩虛等病機轉(zhuǎn)變，尤以氣陰兩虛證為多見[7]。生脈飲為中醫(yī)治療氣陰兩虛型疾病的重要方劑，其由人參、麥冬、五味子組成，方中人參甘溫，益元氣，補肺氣，生津液；麥冬甘寒養(yǎng)陰，潤肺生津；人參、麥冬合用，則益氣養(yǎng)陰之功益彰；五味子酸溫，斂肺止汗，生津止渴，共奏益氣養(yǎng)陰之功效。本研究擬探討生脈飲聯(lián)合順鉑對氣陰兩虛型Lewis肺癌荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57小鼠40只，雌雄各半，年齡4～6周，重量約18～22 g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證編號為SCXK(晉）2015-0001。喂養(yǎng)飼料由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗嚴格遵守國家衛(wèi)生研究院(NIH）實驗動物飼養(yǎng)及使用指南。實驗動物采用隨機數(shù)字表的方法，隨機分為模型組、生脈飲組、順鉑組及生脈飲聯(lián)合順鉑組各10只小鼠。飼養(yǎng)在山西醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級實驗室。實驗前全部小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，室溫22℃～26℃，相對濕度40%～60%，自由飲水、采食。動物室保持安靜，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 實驗細胞株 Lewis肺癌細胞株，由山西醫(yī)科大學細胞庫提供。

1.3 實驗藥物 生脈飲：規(guī)格：10 ml/支，10支/盒，批號：國藥準字Z11020363，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠提供；順鉑：規(guī)格：10 mg/支，批號：H20040813，購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司；兔抗小鼠β-catenin蛋白單克隆抗體，購于Santa Cruz；免疫組化檢測SP試劑盒購于武漢華美生物科技有限公司；DAB顯色液購于武漢華美生物科技有限公司；造模中藥：麻黃、制附子、細辛、天南星各9克，購自山西省中醫(yī)院，水煎濃縮到1g/ml，冰箱存放。

1.4 實驗方法

1.4.1 構(gòu)建氣陰兩虛型Lewis肺癌荷瘤小鼠模型

造模方法參考文獻[8]方法進行，40只小鼠給予溫熱性中藥灌胃，每只0.4 ml，每天1次，每天灌胃后放置于密閉的玻璃箱中刨花煙熏，每次30 min，小鼠自然吸入，連續(xù)10 d，建立氣陰兩虛模型，第11天，將凍存于液氮中Lewis肺癌細胞取出，復蘇培養(yǎng)，使用細胞計數(shù)板計數(shù)，按照1×107個/mL細胞濃度，0.2 mL/只注射到40只小鼠右側(cè)前肢腋下，全程無菌操作，建立氣陰兩虛型肺癌實驗動物模型，接種后第7天，造模小鼠右腋下均可觸及瘤塊，即氣陰兩虛Lewis移植瘤小鼠動物模型建立成功。

1.4.2 Lewis肺癌荷瘤小鼠的分組給藥

小鼠接種腫瘤后，待腫瘤生長至第14天時，按不同組別給藥，給藥方案如下：模型組(A組）：0.2 mL生理鹽水灌胃；順鉑組(B組）：0.2 mL腹腔注射，隔天給藥1次，共7次；生脈飲組(C組）：0.2 mL灌胃；生脈飲+順鉑組(D組）：0.2 mL生脈飲灌胃+0.2 mL順鉑腹腔注射，隔天給藥1次，共7次，以上灌胃均持續(xù)14天。

1.5 觀察指標

1.5.1 腫瘤抑制率和生命延長率

每天密切觀察小鼠生活狀態(tài)(精神、進食、毛發(fā)色澤、活動、聚集現(xiàn)象）和體質(zhì)量變化，接種腫瘤后，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤最長徑a和最短徑b，單位cm，做詳細記錄，計算腫瘤體積V(V=ab2/2）。計算腫瘤抑制率=(V陰性對照組-V處理組）/V陰性對照組×100%。同時每天記錄C57小鼠平均存活時間T ，計算生命延長率=(T實驗組/T對照組-1）×100%。觀察期直到所有C57小鼠死亡為止(當腫瘤出現(xiàn)潰瘍或皮下腫瘤長至12 mm大小時，也以小鼠死亡對待，斷頸處死[9]）。

1.5.2 檢測腫瘤組織中β-catenin蛋白表達

免疫組化的步驟：將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3% H2O2在室溫條件下孵育5～10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后倒掉H2O2，用蒸餾水沖洗兩次，以使抗原的位點暴露出來，再用PBS浸泡5分鐘(該操作進行2次），擦干組織周圍的PBS液，加上血清，使非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時；擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，用PBS沖洗，置于4℃冰箱中保存過夜；將載玻片取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37℃溫箱中半小時；將片子取出,放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后滴加適量辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，然后放入37℃溫箱中半小時，放入PBS中洗3次，每次5 min；用DAB顯色劑顯色3～15分鐘后，用自來水充分沖洗；用蘇木復染、脫水、透明、封片后，置于顯微鏡下觀察成像。

β-catenin蛋白陽性細胞判斷標準：陽性信號是細胞膜呈淡黃至棕黃色顆粒。主要陽性信號集中在細胞膜的細胞＞50%的稱為細胞膜表達，在細胞膜表達的細胞＞50%為正常表達，反之為表達缺失。主要陽性信號集中在細胞質(zhì)的細胞＞50%的稱為細胞質(zhì)表達，主要陽性信號在細胞核的細胞＞10%的稱為有核定位。胞質(zhì)或胞核的表達稱為異位表達，胞膜表達的缺失和異位表達統(tǒng)稱為異常表達。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同處理方法對荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響

由表1可見，各組小鼠初體質(zhì)量和終體質(zhì)量無明顯差異(P＞0.05），生脈飲和順鉑不影響小鼠的體質(zhì)量增長。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化(±s）Table 1 Changes of body weight of mice in each group

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化(±s）Table 1 Changes of body weight of mice in each group

組別模型組生脈飲組順鉑組生脈飲+順鉑組只數(shù)(只）8 9 8 9初體質(zhì)量(g）20.53±0.41 20.58±0.39 20.49±0.38 20.56±0.43終體質(zhì)量(g）34.41±0.46 35.02±0.45 34.37±0.48 33.83±0.64

圖1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Figure 1 Changes of body weight of mice in each group

2.2 不同處理方法對小鼠瘤重及抑瘤率的影響

由表2可見，與模型組相比，生脈飲組、順鉑組、(生脈飲+順鉑組）瘤重均減輕(P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義，說明各組均有明顯的抑瘤作用；三組間兩兩相比(P＞0.05），差異均無統(tǒng)計學意義，說明三組在抑制小鼠腫瘤生長的作用方面差異不明顯。

表2 各組小鼠瘤重及抑瘤率的比較(±s）Table 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

表2 各組小鼠瘤重及抑瘤率的比較(±s）Table 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

組別模型組生脈飲組順鉑組生脈飲+順鉑組只數(shù)(只）8 9 8 9瘤重(g）2.34±0.52 1.83±0.56 1.62±0.47 1.42±0.38抑瘤率(%）0 21.79 30.77 39.32

圖2 各組小鼠瘤重及抑瘤率的比較Figure 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

2.3 不同處理方法對小鼠平均存活時間及生命延長率的影響

由表3可見，與模型組相比，各組小鼠平均存活時間均有所延長(P＜0.05），說明各組均有明顯的延長生命周期的作用。生脈飲聯(lián)合順鉑組的小鼠生命延長率為64.26%，而生脈飲組的小鼠生命延長率為51.33%，二者相比，P＜0.05，說明生脈飲聯(lián)合順鉑組延長生命周期的作用優(yōu)于生脈飲組，表明中西藥聯(lián)用對延長肺癌小鼠生命周期的作用效果比單獨用中藥效果好。

表3 各組小鼠平均存活時間及生命延長率的變化(±s）Table 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

表3 各組小鼠平均存活時間及生命延長率的變化(±s）Table 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

注：與模型組比較，①P＜0.05；與生脈飲組比較，②P＜0.05。

只數(shù)(只） 生命延長率(%）51.33 56.27 64.26組別模型組生脈飲組順鉑組生脈飲+順鉑組8 9 8 9平均存活時間(d）26.3±2.1 39.8±3.6①41.1±1.8①43.2±2.4①②

圖3 各組小鼠平均存活時間及生命延長率的變化Figure 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

2.4 不同處理方法對荷瘤小鼠腫瘤組織β-catenin表達的影響

從表4可以看出，與模型組(87.5%）相比，各組小鼠腫瘤組織β-catenin異常表達率均明顯降低，其中，聯(lián)合用藥組的異常表達率最低，為33.3%(P＜0.05），順鉑組與生脈飲組之間無明顯差異(P＞0.05）。

表4 各組小鼠β-catenin蛋白表達的比較Table 4 Comparison of β-catenin protein expression of mice in each group

3 討論

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升，但生存率較低，化療藥物和外科手術(shù)作為主要的治療手段，對患者的機體功能有一定損害，而中醫(yī)藥在防治腫瘤方面副作用小、安全性高，逐漸展現(xiàn)出其臨床優(yōu)勢。

本研究以生脈飲與順鉑為對象，首先探討了其抗腫瘤效果。結(jié)果表明，二者均可使Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤大小降低，存活天數(shù)增多，經(jīng)生脈飲聯(lián)合順鉑治療的Lewis肺癌荷瘤小鼠效果更加顯著，說明生脈飲聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長具有顯著抑制作用。

生脈飲為中醫(yī)治療氣陰兩虛型疾病的重要方劑，由人參、麥冬、五味子組成，其中，人參的主要活性物質(zhì)人參皂苷Rg5能抑制多種腫瘤細胞的增殖，誘導癌細胞周期阻滯和凋亡，同時也可增強免疫調(diào)節(jié)來抑制腫瘤增殖，起到抗腫瘤作用[10]；麥冬的皂苷成分DT-13可通過抑制血管新生達到防治腫瘤的目的，同時可降低細胞黏附，抑制腫瘤細胞的侵襲；此外，從麥冬中提取到的凝集素既可抗腫瘤細胞增殖，又可誘導腫瘤細胞凋亡[11]；五味子酯乙可通過底物競爭性抑制P-gp的藥物外排功能和下調(diào)其蛋白水平，達到治療肺癌的目的[12]，“人參－五味子”這一藥對配伍通過調(diào)控機體激素及致癌物質(zhì)代謝、免疫耐藥、炎癥反應(yīng)，對肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥發(fā)揮防治作用[13]。

β-catenin則是一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物學指標，它是一種胞質(zhì)蛋白，在細胞中起兩種作用，其一為組成細胞黏附/肌動蛋白細胞骨架的結(jié)構(gòu)組分。β-catenin能與E-cadherin結(jié)合，參與細胞黏附、生長和增殖等過程。二是作為信號轉(zhuǎn)導分子的游離β-catenin在基因轉(zhuǎn)錄中起一定作用。大多數(shù)β-catenin結(jié)合于質(zhì)膜，介導鈣粘素依賴的細胞間粘連，小部分β-catenin存在于胞質(zhì)與核內(nèi)，由Wnt信號調(diào)節(jié)。

所以β-catenin既是一種細胞黏附分子，也是Wnt信號途徑重要的效應(yīng)物，在Wnt信號途徑和鈣黏蛋白一環(huán)連蛋白復合體中都起作用。據(jù)文獻報道，Wnt/β-catenin信號通路的異常活化與多種癌癥相關(guān)，包括但不限于肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌，其中β-catenin作為Wnt信號通路中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)控細胞凋亡、分化、生長及黏附等過程[14]。在腫瘤組織中，βcatenin是一種促癌因子，β-catenin活化后，下游Cyclin D1、c-Myc等效應(yīng)分子表達增加，導致腫瘤發(fā)生[15]。

本實驗結(jié)果顯示，β-catenin蛋白的異常表達以模型組最高，說明β-catenin蛋白的異常表達是腫瘤生長、擴散的重要因素；與模型組相比，其余各組均有明顯下降，說明生脈飲、順鉑均可在一定程度上減少β-catenin蛋白的異常表達；而聯(lián)合用藥組的異常表達最低，說明兩種藥合用可以顯著減少β-catenin蛋白的異常表達，減慢腫瘤組織的生長及擴散的速度。

本實驗旨在觀察中藥生脈飲的抗癌作用，及其與順鉑合用以減毒、增效的作用，并對其機理β-catenin表達的影響進行了初步探討。因受多種因素的影響，本課題實驗尚存在許多不足之處。如只做了各組小鼠的體質(zhì)量、抑瘤率、生命延長率以及腫瘤組織中β-catenin蛋白的表達的測定，未對其他的免疫指標進行測定，研究不夠廣泛。

綜上所述，生脈飲聯(lián)合順鉑使用具有一定的抗腫瘤作用，可以用來治療氣陰兩虛型肺癌，二者聯(lián)用或可通過減低化療藥物的毒性和提高化療藥物的療效來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，達到一定的治療目的，提高患者生存質(zhì)量，可以嘗試在臨床上推廣使用。