拜顫停復(fù)方在大鼠腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)研究

盧芳，張冶，白宛鑫，盧意，吳娟，劉樹(shù)民

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是一種常見(jiàn)于50歲以上中老年人的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，并且隨著年齡增長(zhǎng)其發(fā)病率也隨之增加[1]。PD的發(fā)病原因尚不明確，其主要病理變化是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及紋狀體多巴胺顯著減少，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩以及情緒低落、焦慮等[2]。復(fù)方拜顫停是臨床治療PD的經(jīng)驗(yàn)方，由刺五加、白芍、鉤藤三味藥組成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，拜顫停復(fù)方可通過(guò)回調(diào)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的PD模型小鼠的IL-1β、IL-6等炎性指標(biāo)保護(hù)神經(jīng)元并通過(guò)改善SOD、GSH-Px等指標(biāo)提高機(jī)體的抗氧化和清除自由基能力。為了進(jìn)一步了解拜顫停復(fù)方對(duì)PD主要病變部位腦的作用，本實(shí)驗(yàn)選取異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿作為復(fù)方拜顫停的代表性成分，研究各目標(biāo)成分在正常及PD模型大鼠腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)區(qū)別，從藥代動(dòng)力學(xué)角度闡述復(fù)方拜顫停治療帕金森疾病的作用機(jī)制，并為拜顫停復(fù)方的新藥開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 試劑

紫丁香苷對(duì)照品(批號(hào)：110873-201012)，異嗪皮啶對(duì)照品(批號(hào)：110673-201105)，刺五加苷E對(duì)照品(批號(hào)：110736-201006)，芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110482-201009)，異鉤藤堿對(duì)照品(批號(hào)：110284-201102)，葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-201012)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜級(jí)，美國(guó)ROE Scientific公司)；MPTP(上海德默醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20141019)；娃哈哈純凈水；拜顫停片(本實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合世一堂制藥廠制備，批號(hào)：1905307，0.4 g片，其中含異嗪皮啶0.20%，紫丁香苷0.66%，刺五加苷E0.13%，芍藥苷7.08%，異鉤藤堿0.52%)，用娃哈哈水復(fù)溶后給藥。

1.2 儀器

API4000液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，配有ESI電噴霧離子源，分析軟件為MassLynx4.0；UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；WHL微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；ME235S電子分析天平(德國(guó)Sartourious公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(黑)2019-0001。

2 方法

2.1 給藥方案與樣品采集

SPF級(jí)SD雄性大鼠144只，隨機(jī)分為正常組與模型組，每組72只。模型組腹腔注射MPTP(30 mg·kg-1)連續(xù)7 d[5]，空白組腹腔注射等量生理鹽水。正常組與模型組分別于第8天給藥拜顫停復(fù)方片劑(成人每日給藥量9片，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出大鼠每日給藥量為926 mg·kg-1)。各組大鼠分別于給藥前與給藥后的0.16、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h處死6只大鼠，取出腦組織用生理鹽水洗去殘血，濾紙吸干后稱重，記錄重量，取0.5 g各組織，以組織：生理鹽水=1∶2的比例進(jìn)行勻漿得到組織勻漿液，于4 ℃，15 000 r/min離心10 min，取上清液，得到的組織勻漿樣品在-80 ℃冰箱中保存，待用。

2.2 進(jìn)樣前處理

樣品室溫融化后離心取上清液適量，加入乙腈沉淀蛋白，15 000 r/min離心10 min取上清液，置氮吹儀下于37 ℃吹干，殘?jiān)猛w積的乙腈復(fù)溶，渦旋10 min，于4 ℃，15 000 r/min離心10 min，上清液即為進(jìn)樣溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取紫丁香苷，異嗪皮啶，刺五加苷E，芍藥苷，異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，以甲醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為儲(chǔ)備液。精密移取上述配制好的儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋，配制成各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品0.39 mg，用甲醇制備成0.007 8 mg·mL-1的葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 色譜條件

ACQUITYUPLCTM BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters Corp，Milford，USA；流動(dòng)相：甲醇(A)，0.1%甲酸-水(B)；梯度洗脫(0～2 min，0%～20%A；2～10 min，20%～80%A，10～12 min，80%～20%A)。

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，掃描方式為多反應(yīng)選擇監(jiān)測(cè)，噴霧電壓4 500 V，金屬毛細(xì)管壓力3 KV，N錐孔壓力50 V，源溫度為100 ℃，脫溶劑氣流量為800 L·h-1，錐孔氣流量為80 L·h-1。掃描結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各目標(biāo)成分MRM分析的質(zhì)譜參數(shù)

2.6 數(shù)據(jù)處理

目標(biāo)成分在腦組織中的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)以WinNonlin5．2非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，由Microsoft excel 2010和Origin7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察

取大鼠的空白腦組織樣本、空白腦組織+混合對(duì)照品溶液+內(nèi)標(biāo)樣本、大鼠給藥1 h后收集的腦組織樣本，樣品前處理后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如圖1～6所示，結(jié)果表明該方法專屬性良好。

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖1 異嗪皮啶質(zhì)譜圖

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖2 紫丁香苷質(zhì)譜圖

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖3 刺五加苷E質(zhì)譜圖

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖4 芍藥苷質(zhì)譜圖

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖5 異鉤藤堿質(zhì)譜圖

注：1．空白組腦組織樣品；2．空白組腦組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；3．給藥1 h后的腦組織樣品。圖6 葛根素質(zhì)譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限

取空白腦組織樣本100 μL，混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，再加入100 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，樣品前處理后進(jìn)樣分析，采用加權(quán)的(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿在腦組織中的線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=7.247 4x+0.003 3、y=0.072 5x+0.007 6、y=0.021 4x+0.004 2、y=6.954 2x+0.008 4、y=7.563 8x+0.000 9，R2均大于0.998。各目標(biāo)成分的線性范圍均在0.013～1.667 μg·mL-1，定量下限為均為0.013 μg。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

制備各標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1 667、417、26 ng·mL-1的3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣本進(jìn)行測(cè)定，每一濃度5個(gè)平行樣，連續(xù)測(cè)定3 d。在腦組織勻漿中，3個(gè)質(zhì)控樣本的日內(nèi)RSD%在2.17%～12.29%，RE%在-12.04%～10.77%；日間RSD在0.35%～10.75%，RE在-11.96%～11.65%，說(shuō)明準(zhǔn)確度與精密度良好。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

在大鼠腦組織中，各目標(biāo)成分3個(gè)濃度的質(zhì)控樣本(1667 ng·mL-1、417 ng·mL-1、26 ng·mL-1)提取回收率平均值均在87.04%～104.83%，RSD值均在2.82%～9.16%；基質(zhì)效應(yīng)平均值均在88.73%～97.53%范圍內(nèi)，RSD值在2.71%～10.37%，說(shuō)明各目標(biāo)成分在腦組織中提取回收率高，重復(fù)性好，且各組織對(duì)目標(biāo)成分無(wú)基質(zhì)效應(yīng)干擾，不影響該方法的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。

3.5 穩(wěn)定性

樣品于室溫放置4 h、-20 ℃存放4周、-20 ℃取出后于室溫融化并反復(fù)凍融3次、室溫下在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12 h條件下考察穩(wěn)定性。在以上條件下各指標(biāo)成分在腦組織中的RSD均小于15%，表明在腦組織中的所有目標(biāo)成分在各種條件下的穩(wěn)定性均良好。

3.6 拜顫停復(fù)方中各指標(biāo)成分在大鼠腦組織的藥代動(dòng)力學(xué)

空白組與模型組給藥后拜顫停復(fù)方代表性成分異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿在大鼠腦組織中平均藥時(shí)曲線如圖7所示，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。結(jié)果表明，各目標(biāo)成分在模型組腦組織中的濃度均大于空白組大鼠腦組織中的濃度，且與空白給藥組相比，模型給藥組各代表性成分的Cmax與AUC均有顯著升高，其中異嗪皮啶的Cmax升高了2倍，AUC升高了2.55倍，紫丁香苷的Cmax升高了2.94倍，AUC升高了1.85倍，刺五加苷E的Cmax升高了7倍，AUC升高了4.04倍，芍藥苷的Cmax升高了2.17倍，AUC升高了3.01倍，異鉤藤堿的Cmax升高了1.53倍，AUC升高了1.42倍。

注：a.0～48 h; b.0～12h。圖7 給予拜顫停復(fù)方后腦組織中異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷、異鉤藤堿的平均藥時(shí)曲線

表2 刺五加中代表性成分在腦中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討論

中藥復(fù)方中成分復(fù)雜，且各成分之間相互作用最終協(xié)同發(fā)揮藥效。此前對(duì)中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的研究中多數(shù)只選擇其中1～2種有效成分進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)特征分析并以此來(lái)代表全方的藥動(dòng)學(xué)特征，這樣的研究方式顯然是不全面的[6]。關(guān)于中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)研究，其重點(diǎn)在于指標(biāo)成分的選擇是否能代表整個(gè)藥方[7-9]。拜顫停復(fù)方中，刺五加作為君藥，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效，同時(shí)配伍養(yǎng)血柔肝、平抑肝陽(yáng)的白芍與熄風(fēng)定驚、清熱平肝的鉤藤，意在通過(guò)平肝益腎法達(dá)到治療PD的目的。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，本文針對(duì)拜顫停復(fù)方中三味藥刺五加、白芍與鉤藤分別選取其中具有代表性的有效成分異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿，研究該5種成分在大鼠腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)特征，意在更為全面的了解拜顫停復(fù)方在大鼠腦組織內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布過(guò)程，進(jìn)而從藥代動(dòng)力學(xué)角度詮釋拜顫停復(fù)方治療帕金森病的作用機(jī)制。

給藥10 min后，各指標(biāo)成分在腦組織中均能檢測(cè)到，說(shuō)明拜顫停復(fù)方經(jīng)口給藥后該5種成分均能迅速入血并分布到腦組織中。從圖2中發(fā)現(xiàn)，模型組的紫丁香苷、刺五加苷E與芍藥苷均出現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，且第二個(gè)吸收峰出現(xiàn)時(shí)間均在10 h左右，說(shuō)明在PD疾病狀態(tài)下，藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間延長(zhǎng)，藥效發(fā)揮更為持久。紫丁香苷與刺五加苷E的第一峰明顯高于第二峰，結(jié)合前期課題組在組織分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，肝臟與小腸藥物濃度變化趨勢(shì)相反，進(jìn)而推測(cè)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象的原因是由于肝腸循環(huán)。PD疾病可以導(dǎo)致患者發(fā)生睡眠障礙，從而使酶的活性降低，從表2中發(fā)現(xiàn)，紫丁香苷在腦組織中的暴露量明顯高于其他指標(biāo)，可能是由于其具有恢復(fù)微粒體酶系統(tǒng)的酶活性作用的原因。在5種被測(cè)成分中，芍藥苷的給藥劑量高于其它四種成分，但其AUC卻小于紫丁香苷和異鉤藤堿，可能是由于芍藥苷在血漿中會(huì)代謝為去葡萄糖-6-O-乙酰芍藥苷和4-O-脫甲基苯甲酰芍藥苷[10]，只有一部分以原型的形式輸送至各組織器官中發(fā)揮作用。本課題組經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，鉤藤提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)PD模型小鼠腦黑質(zhì)區(qū)的GSH-Px、SOD、MDA、IL-6、IL-1β指標(biāo)來(lái)達(dá)到對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用。白芍廣泛應(yīng)用于治療帕金森的經(jīng)典方中，其主要活性成分芍藥苷對(duì)神經(jīng)具有很好的保護(hù)及調(diào)節(jié)作用[12]；張琳等[13]人認(rèn)為刺五加對(duì)腦細(xì)胞及多巴胺神經(jīng)元具有保護(hù)作用。異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿在PD大鼠模型腦組織中的分布均高于正常組，模型組的Cmax與AUC均有不同程度的升高，說(shuō)明各指標(biāo)成分在模型組的生物利用度更高，與腦組織的親和力更強(qiáng)，在病理模型中更能明顯的發(fā)現(xiàn)該5種指標(biāo)成分均能夠選擇性的分布于腦組織中。陳歡等[14]人發(fā)現(xiàn)，PD疾病的發(fā)生可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群的紊亂，主要體現(xiàn)在幽門(mén)螺旋桿菌的感染及小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)等。由于腸道菌群在藥物吸收與生物轉(zhuǎn)化方面有重要作用[15]，提示腸道菌群的失調(diào)也有可能是導(dǎo)致拜顫停復(fù)方中5種指標(biāo)成分在PD模型中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生變化的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)建立了拜顫停復(fù)方代表性成分異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷與異鉤藤堿在大鼠腦組織中的UPLC-MS測(cè)定方法，并得到了該5種有效成分在生理大鼠及PD模型大鼠腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為未來(lái)拜顫停復(fù)方在臨床的合理用藥及新藥研發(fā)等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。