孕婦VDR基因Fok I位點多態(tài)性與臍血25-羥維生素D的關系研究

陳楊萍 徐峰 林蒙蒙 戴曉曉 胡曉霞 張燁

佝僂病是嚴重影響兒童骨骼發(fā)育的疾病之一，大多是由體內維生素D缺乏或不足引起鈣、磷代謝紊亂，造成鈣鹽在骨骼生長的過程中無法正常沉著，從而導致成年后出現(xiàn)骨痛、骨折及骨骼畸形的慢性營養(yǎng)缺乏性疾病。目前研究較多的是胎兒出生后的骨骼發(fā)育，較少關注胎兒期的骨骼發(fā)育情況。新生兒佝僂病是指在新生兒期發(fā)生的鈣、磷和（或）維生素D缺乏引起的鈣磷代謝失常，造成生長中的骨樣組織過多積聚和（或）骨骼基質鈣鹽沉著障礙的代謝性骨病，有一部分新生兒在出生時就發(fā)生，即稱為先天性佝僂病，在我國目前并不少見，一旦錯失最佳的治療時機，就會發(fā)生不可逆的骨骼畸形。孕母25-羥維生D水平是新生兒體內維生素D儲備的主要來源[1]，孕母維生素D不足可引起新生兒骨骼鈣化不良、生長發(fā)育遲緩及先天性佝僂病[2]。研究表明維生素D受體（vitamin D receptor,VDR）基因多態(tài)性與維生素D缺乏性佝僂病[3]、小鼠子代骨骼發(fā)育不良[4]及兒童呼吸系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)疾病[5]的發(fā)生相關。Yasovanthi等[6]的研究提示VDR基因Fok I位點與低骨量、骨質疏松及佝僂病有一定的相關性。本研究旨在分析孕婦VDR基因Fok I多態(tài)性與臍血25-羥維生素D水平的關系，以期為預防新生兒先天性佝僂病提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年6月至2019年5月在溫州市中心醫(yī)院產檢的846例孕婦為研究對象，均為單胎。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有參加本研究的孕婦均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 于孕早期測量孕婦身高、體重、BMI，設計問卷調查表，排除妊娠期糖尿病、高血壓病、風濕免疫性疾病、染色體異常、甲狀腺異常及骨代謝異常相關疾病。記錄孕婦孕期服用鈣量及維生素D3、腓腸肌痙攣等情況。研究者查詢不同品牌鈣補充劑的劑量，根據(jù)說明書含量轉換為孕期補充維生素D3含量（單位為U）和鈣劑含量（單位為 mg），記錄新生兒出生時的基本情況。

1.2.2 孕婦VDR基因Fok I多態(tài)性及25-羥維生素D水平檢測 孕晚期檢測孕婦血液中VDR基因Fok I多態(tài)性，采用PCR-焦磷酸遺傳分析技術。（1）提取：使用長沙三濟生物科技有限公司全血DNA基因提取試劑盒提取患者血液中白細胞DNA，置于-20℃保存。（2）擴增：反應體系為25μl，擴增條件為95℃預變性3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共 45個循環(huán)。前引物：5'-GTGGCCTGCTTGCTGTTC-3'，后引物：5'-ACAGATCCGGGGCACGTT-3'， 測 序 引 物 ：5'-TTGCTGTTCTTACAGGG-3'。（3）焦磷酸測序：用 PyroMark Q24 測序儀（德國凱杰公司）隨機選擇10%樣本PCR產物進行焦磷酸基因測序，最后用PyroMark Q24 MDx Software查看測序結果。

1.2.3 25-羥維生素D水平檢測 取孕婦孕晚期靜脈血5 ml，新生兒出生斷臍后抽取臍靜脈血3 ml。置于惰性分離膠促凝管及快速血清管，3 000 g離心10 min，將血清標本置于-80℃冰箱保存，并于48 h內檢測25-羥維生素D水平。采用美國SHD公司生產的總維生素D測試試劑盒（化學發(fā)光法）檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件?；蛐图暗任换蚍植碱l率用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗[7]。計量資料以表示，多組比較用單因素方差分析。計數(shù)資料以頻數(shù)和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 為評價基因頻率估計的可靠性，對846例孕婦VDR基因Fok I位點的基因型進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，結果顯示其等位基因的位點分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明該組孕婦在溫州地區(qū)孕婦人群中具有良好的代表性（χ2=1.27，P＞0.05）。

2.2 不同基因型孕婦基本情況比較 846例孕婦中，VDR基因Fok I位點TT基因型206例，占24.35%；TC基因型386例，占45.63%；CC基因型254例，占30.02%。3種不同基因型孕婦年齡、BMI、分娩孕周、服用鈣量和維生素D及戶外活動時間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 不同基因型孕婦的基本情況比較

2.3 不同基因型孕婦的新生兒出生基本情況比較 3種不同基因型孕婦的新生兒出生體重、性別、分娩方式比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同基因型孕婦的新生兒出生基本情況比較

2.4 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平、腓腸肌痙攣情況比較 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平、腓腸肌痙攣情況比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較，VDR基因Fok I位點TT型的孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平＜TC型＜CC型（均P＜0.05），TT型和TC型均顯示25-羥維生素D水平不足；TT型孕婦的腓腸肌痙攣發(fā)生率亦較高（均P＜0.05），見表3。

表3 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D濃度、腓腸肌痙攣比較

3 討論

維生素D是一種脂溶性開環(huán)固醇類物質，包括植物來源的維生素D2和動物來源的維生素D3，其在體內經25羥化酶作用下形成25-羥維生素D，再經過1α位羥化成為 1,25（OH）2D3，通過與組織中廣泛存在的VDR結合，發(fā)揮激素樣作用。維生素D主要生理作用是促進鈣和磷在腸道中吸收，并抑制甲狀旁腺素（parathyroid hormone,PTH）釋放，維持血鈣和磷水平正常，進而保證骨骼正常礦化。有研究報道，維生素D還對代謝、免疫、腫瘤發(fā)生、妊娠和胎兒發(fā)育等方面也有一定的影響[8]。VDR基因位于染色體12q12-14上，有8個內含子和9個外顯子組成。VDR基因編碼的維生素D受體蛋白，能特異地結合1,25（OH）2D3，發(fā)揮調節(jié)軟骨細胞增生、分化及成骨細胞、破骨細胞的生物學行為，從而影響骨骼的發(fā)育。目前研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性主要有4個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點對骨代謝有重要的影響，分別為Fok I、Bsm I、Apa I及 Taq I限制性酶切位點。Fok I限制性位點多態(tài)性位于2號外顯子，存在T/C轉換多態(tài)性，導致編碼氨基酸密碼子427ACG＞ATG突變，一般以等位基因F、f表示，f表示存在Fok I酶切位點，F(xiàn)表示缺乏Fok I酶切位點，兩者可有3種不同的組合（FF、Ff、ff或 CC、TC、TT）。葉侃等[9]的研究表明 Fok I 位點TT型基因型可能是佝僂病的遺傳學危險因素。體內維生素D的不足和缺乏可導致非特異性骨骼肌肉痛（non-specific musculosk-eletal pain,NSMP）、骨質疏松、呼吸系統(tǒng)疾病、內分泌疾病及炎癥性腸病等。有研究報道，NSMP患者血清中25-羥維生素D大多數(shù)缺乏，疼痛程度與其血清25-羥維生素D水平為負相關[10]。25-羥維生素D因其性質穩(wěn)定，半衰期長，在血清中水平高，故可作為反應體內維生素D營養(yǎng)狀況的可靠指標。2016年全球多學科專家共同制定的《全球營養(yǎng)性佝僂病防治共識》中規(guī)定維生素D狀況：充足為＞50 nmol/L（20 ng/ml）；不足為 30～50 nmol/L（12～20 ng/ml）；缺乏＜30 nmol/L（12 ng/ml）。據(jù)針對中國不同緯度城市的相關研究顯示，目前我國維生素D的缺乏或不足現(xiàn)象比較普遍[11-13]。維生素D是人體必須的營養(yǎng)物質，通過陽光照射、經口攝入和胎兒母體轉運獲得。嬰幼兒作為一類特殊的群體，早期維生素D的需求主要通過臍帶轉運來自孕母體內的維生素D。Misra等[14]研究表明孕期維生素D的缺乏可導致新生兒佝僂病。

新生兒佝僂病主要是由于體內維生素D缺乏而引起鈣磷代謝異常而導致的生長期骨礦化不全，產生以骨骼病變?yōu)樘卣鳎瑫r影響嬰幼兒神經、肌肉、免疫功能的全身慢性營養(yǎng)性疾病。有學者研究表明新生兒期的代謝性骨病對兒童以后的身高有重要的遠期影響[15]。95%的新生兒先天性佝僂病的原因是母體和新生兒體內鈣劑、磷劑和維生素D的相對不足[16]。人類骨骼發(fā)育從胎兒期開始，胎兒期的骨骼發(fā)育所需80%的鈣都是在妊娠最后3個月從母體獲得的。孕母體內維生素D的水平和新生兒出生時的胎齡可影響新生兒體內的維生素D水平。1,25（OH）2D3是體內維生素D的主要形式，而胎兒的1,25（OH）2D3完全由母體通過胎盤絨毛膜受血面提供的。因此孕母和新生兒臍血25-羥維生素D水平密切相關，有研究表明孕母體內維生素D缺乏的嬰兒、早產或雙胎兒出生后其血清維生素D亦不足[17-19]。李雪香等[20]及池美珠等[21]的研究表明新生兒臍血25-羥維生素D水平與孕母外周血25-羥維生素D水平呈正相關，在池美珠的研究中孕母體內合適的維生素D水平不僅可保護胎兒的骨骼發(fā)育，還可降低子代精神分裂或雙相情感障礙的發(fā)生風險。

那么，VDR基因多態(tài)性是通過哪種途徑影響VDR的功能？有研究表明，VDR基因SNP可能通過影響維生素D受體的mRNA表達，從而導致受體蛋白活性或者數(shù)量上不同，進而通過調節(jié)基因反式放大作用[22]。另有一種假說提出可能在維生素D基因上有其他未知的多態(tài)性位點或在VDR基因所在的第12號染色體上存在其他相關聯(lián)的基因位點與佝僂病遺傳易感性相關，通過與VDR等位基因相連鎖進而影響疾病過程[23]。也有學者認為ATG突變?yōu)锳CG，F(xiàn)位點的VDR蛋白質較f位點短3個氨基酸長度，故與配體親和力、mRNA的穩(wěn)定性和轉運的活力較f位點高，從而增加腸道對鈣的吸收，促進鈣磷在骨骼中的沉積[24-25]。本研究中孕婦VDR基因型為TT型者，血清中25-羥維生素D水平最低，對應的臍血25-羥維生素D水平亦最低，TC型次之，提示VDR基因Fok I位點TT型吸收維生素D能力差，進而導致新生兒缺乏25-羥維生素D，有可能造成新生兒先天性佝僂病。筆者建議對孕婦進行VDR基因Fok I位點多態(tài)性及血清25-羥維生素D水平的檢測，及時個體化補充維生素D，以預防嬰幼兒先天性佝僂病的發(fā)生。