SLPI在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制研究

潘淑芬 嚴育宏 吳潔麗

在全球范圍內，卵巢癌是女性最常見癌癥之一，為女性癌癥死亡的第八位原因，5年生存率低于45%；雖然大多數(shù)高收入國家的年齡標準率很穩(wěn)定或在下降，但許多中低收入國家的年齡標準率都在上升[1-2]。探討影響卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機制對于卵巢癌的診治有重要意義。分泌性白細胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI）是一種黏膜上皮細胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白，在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達[3]。研究表明，SLPI的表達水平與腫瘤遷移、侵襲能力呈正相關，且SLPI高表達會促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡[4]。Zuo等[5]發(fā)現(xiàn)SLPI在卵巢癌中表達上調，提示SLPI可能與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展有關。基于此，本研究通過構建不同SLPI表達水平的卵巢癌細胞株，探討SLPI對卵巢癌細胞增殖、凋亡及侵襲、遷移能力的影響，以期為卵巢癌基因靶向治療藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Nude雌性裸鼠（體重22～25 g，6～7周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證：北京 SYXK（京）2017-0033。清潔級環(huán)境分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：12 h光照黑暗交替、溫度（25±1）℃、相對濕度（60±5）%，自由飲水、進食，1周后開展實驗。人正常卵巢上皮細胞株IOSE80購自鈺博生物有限公司。卵巢癌細胞系SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063及人腎上皮細胞系293T購于中國科學院上海細胞庫；OptiMEM（批號：31985062，100 ml）購自美國Thermo Fisher公司；FBS（批號：35-081-CV，500 ml）、DMEM 培養(yǎng)基（批號：10-013-CV，500 ml）購自美國 Corning公司；CCK-8試劑盒（批號：C0037，100T）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062M，50T）購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室（批號：3422）、基質膠（批號：356234，5 ml）購自美國Corning 公司；一抗：兔抗 SLPI（批號：89199S，100 μl）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）（批號：13110T，20 μl）、半胱天冬酶 3（Cleaved Caspase-3）（批號：9664T，20 μl）、半胱天冬酶 9（Cleaved Caspase-9）（批號：20750S，100 μl）購自美國 CST 公司；兔抗細胞周期蛋白1（Cyclin D1）（批號：SAB5700635-100UL）、BCL2相關X 蛋白（BCL2 Associated X Protein,BAX）（批號：SAB5700002-100UL）、B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）（批號：SAB5700577-100UL）購自美國Sigma公司；兔抗 Actin（批號：ARE6011，100μl）購自杭州華安生物技術有限公司；兔抗基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）（批號 10373-2-AP，50 μl）、MMP-9（批號：10375-2-AP，50 μl）、鋅指蛋白（Snail 1）（批號：13099-1-AP，50 μl）、鋅指轉錄因子（Slug）（批號：12129-1-AP，50 μl）購自武漢三鷹生物技術有限公司。Lipofectamine 3000（批號：L3000001，0.1 ml）購自美國Invitrogen公司。Trizol（批號：CW0580，100 ml）、超純 RNA 提取試劑盒（批號：CW0581，50 次）及 UltraSYBR Mixture（Low ROX）（批號：CW2601S，1 ml）購自北京康為世紀生物科技有限公司，PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒（批號：RR036A，200次）購自日本Takara公司。相關儀器：ViiA 7實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司），化學發(fā)光熒光影像分析儀（LAS-4000，日本Fujifilm公司），倒置熒光顯微鏡（Ti-S，日本尼康公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) IOSE80、SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063及293T細胞均培養(yǎng)在含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，并置于5% CO2、37℃飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，待生長匯合度達90%以上時使用胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 卵巢癌細胞SLPI mRNA表達檢測 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。Trizol法提取卵巢癌 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063細胞和人源的正常卵巢上皮IOSE80細胞中mRNA，逆轉成cDNA后利用qRT-PCR法檢測SLPI mRNA表達，以GAPDH為內參。SLPI上游引物：5'-GAGATGTTGTCCTGACACTTGTG-3'； 下 游 引 物 ：5'-AGGCTTCCTCCTTGTTGGGT-3'。GAPDH上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'；下游 引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。按照 2-ΔΔCt法計算基因表達水平。引物均購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司。實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 SLPI干擾及過表達質粒構建 利用Puro-PLKO.1-TRC載體構建SLPI敲降慢病毒質粒。首先設計SLPI shRNA序列，其21 bp核心序列為：5'-CCTGA－CACTTGTGGCATCAAA-3'，將合成的shSLPI序列退火后與限制性內切酶（BamHI）酶切后的PLKO質粒載體連接，轉化后挑質粒測序，選取測序正確的質粒，擴增抽提后即為SLPI干擾敲除質粒shSLPI。而SLPI過表達質粒則利用PLVX-Puro載體進行構建，主要步驟為設計引物通過PCR方法得到SLPI全長序列，再通過同源重組的方法將SLPI全長序列重組到載體上，經(jīng)轉化、測序及擴增后得到SLPI過表達質粒。

1.2.4 SLPI不同表達水平的SKOV-3穩(wěn)轉細胞株構建 取對數(shù)生長期的293T細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于細胞孵箱培養(yǎng)過夜。第2天將shSLPI質粒及輔助質粒PMD2.G與PSPAX2、shScr敲降對照質粒及輔助質粒PMD2.G與PSPAX2、SLPI過表達質粒及SLPI過表達對照質粒分別加入裝有500μl OptiMEM的EP管中，每管含質粒4μg，另取4只EP管分別加入12μl的Lipofectamine 3000，分別在室溫下孵育5 min后將兩管對應混勻，室溫靜置20 min，小心加入到293T中，轉染6 h后換液，48 h后收集細胞上清液離心并過濾后即得病毒液。

取卵巢癌細胞系SKOV-3以5×104個/孔的密度鋪于6孔板中。將上述構建的病毒液與培養(yǎng)基按1∶1分別加入不同孔內，于病毒感染48 h后，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉細胞株，得到以下不同SLPI表達水平及對照的SKOV-3穩(wěn)轉細胞株用于后續(xù)實驗：shScr組（感染shScr病毒，為敲低對照株）、shSLPI組（感染shSLPI病毒，為 SLPI敲低株）、Vector組（感染 Vector病毒，為SLPI過表達株對照）、SLPI組（感染SLPI病毒，為SLPI過表達株）。

1.2.5 SKOV-3穩(wěn)轉細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。取上述4組SKOV-3穩(wěn)轉細胞株，加入適量細胞裂解液冰上裂解30 min后，13 000 r/min，4 ℃，離心 10 min；吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度后加入6×蛋白上樣緩沖液于100℃金屬浴煮10 min。上樣：每孔20μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h，孵育一抗4℃過夜。一抗檢測蛋白包括：SLPI、PCNA、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX、BCL2 及 MMP-2、MMP-9、Snail1 和 Slug。第 2天孵育辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）化學二抗，化學曝光檢測蛋白表達。實驗重復3次，取平均值。

1.2.6 不同SLPI表達水平的SKOV-3細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取上述4組SKOV-3穩(wěn)轉細胞株，消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為4.0×104個/ml，每孔100μl接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后，每孔板可加入10μl CCK-8，37℃后孵育4 h。在M5酶標儀上檢測450 nm處吸光度值，通過吸光度比值計算百分比。實驗重復3次，取平均值。

1.2.7 不同SLPI表達水平的SKOV-3細胞遷移、侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。取上述4組SKOV-3穩(wěn)轉細胞株，消化成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為40 000/個（孔·100μl）的細胞懸液。在Transwell小室的上室中加入細胞懸液300μl，同時下室中加入含血清的完全培養(yǎng)基800μl，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。PBS清洗Transwell小室后，以4%甲醛固定細胞，結晶紫染色，利用倒置顯微鏡拍照并統(tǒng)計遷移的細胞數(shù)。細胞侵襲能力檢測則在Transwell小室中涂基質膠，其余實驗步驟同細胞遷移能力實驗。實驗重復3次，取平均值。

1.2.8 不同SLPI表達水平的SKOV-3細胞凋亡率檢測 采用流式細胞儀。取上述4組SKOV-3穩(wěn)轉細胞株，消化成單細胞懸液，按照Annexin V-FITC凋亡細胞試劑盒的說明書對細胞染色，使用流式細胞儀在60 min內檢測，cellquest軟件分析細胞凋亡百分比。實驗重復3次，取平均值。

1.2.9 裸鼠皮下移植瘤實驗 取上述4組SKOV-3穩(wěn)轉細胞株，消化成單細胞懸液，用PBS重懸并稀釋至濃度為5×106個/ml，將裸鼠麻醉后，在裸鼠皮下注射5×105個/100μl細胞懸液。各組裸鼠數(shù)量分別為：shScr組4只裸鼠；shSLPI組5只裸鼠；Vector組5只裸鼠；SLPI組4只。3周后處死裸鼠，取皮下瘤拍照并稱重。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063SLPI、ISOE80細胞SLPI mRNA表達水平比較 與ISOE80細胞相比，卵巢癌 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063細胞中SLPI mRNA表達水平均升高（均P＜0.05），見表1。后續(xù)選取SKOV-3細胞系構建穩(wěn)定過表達和敲低細胞株進行后續(xù)實驗。

表1 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063SLPI、ISOE80細胞SLPI mRNA表達水平比較

2.2 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞增殖率及增殖相關蛋白表達水平比較 CCK-8結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05）；與Vector組相比，SLPI組細胞增殖率明顯升高（P＜0.05）。Western blot結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞PCNA、Cyclin D1蛋白表達水平明顯降低（均 P＜0.05）；與 Vector組相比，SLPI組 PCNA、Cyclin D1蛋白水平明顯升高（均P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 shScr組、shSLPI組、Vector組、SLPI組細胞增殖相關蛋白增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白1（Cyclin D1）表達電泳圖

表2 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞增殖率比較

2.3 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達水平比較 流式細胞術結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞凋亡率明顯升高[（20.9±1.05）%比（3.74±0.12）%，P＜0.05]；與Vector組相比，SLPI組細胞凋亡率明顯降低[（1.67±0.09）%比（3.50±0.14）%，P＜0.05]。Western blot結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX的表達水平明顯升高（均P＜0.05），凋亡抑制蛋白BCL2表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Vector對照組相比，SLPI組促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX 的表達水平明顯降低（均P＜0.05）；凋亡抑制蛋白BCL2表達明顯升高（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達水平比較 [a為細胞凋亡率比較；b為凋亡相關蛋白表達電泳圖（Cleaved Caspase-3為胱天蛋白酶-3；BAX為凋亡調節(jié)劑BAX；Cleaved Caspase-9為胱天蛋白酶-9；BCL2為B淋巴細胞瘤-2基因；Actin為肌動蛋白）]

2.4 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞遷移率、侵襲率及遷移侵襲相關蛋白表達水平比較Transwell小室遷移和侵襲實驗結果均顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞遷移率和侵襲率明顯降低（均P＜0.05）；與Vector對照組相比，SLPI組細胞遷移率和侵襲率明顯升高（均P＜0.05）。Western blot結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組細胞遷移侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9、Snail 1、Slug表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；與Vector組相比，SLPI組細胞遷移侵襲相關蛋白 MMP-2、MMP-9、Snail 1、Slug 表達水平明顯升高（均P＜0.05）。見圖3-4。

圖3 Transwell檢測shScr組、shSLPI組、Vector組、SLPI組細胞遷移和侵襲能力（a為遷移能力比較；b為侵襲能力比較；結晶紫染色，×100）

2.5 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞皮下移植瘤生長情況比較 裸鼠皮下移植瘤結果顯示，與shScr組相比，shSLPI組裸鼠皮下移植瘤明顯偏??；與Vector組相比，SLPI組裸鼠皮下移植瘤明顯增大。瘤重稱量結果同樣顯示，與shScr組相比，shSLPI組裸鼠皮下移植瘤瘤重明顯偏?。≒＜0.05）；與Vector組相比，SLPI組裸鼠皮下移植瘤瘤重明顯偏大（P＜0.05）。見圖5。

圖4 shScr組、shSLPI組、Vector組、SLPI組細胞遷移侵襲相關蛋白表達電泳圖（MMP-2為基質金屬蛋白酶2；MMP-9為基質金屬蛋白酶9；Snail 1為鋅指蛋白SNAI1；Slug為鋅指轉錄因子；Actin為肌動蛋白）

圖5 shScr組與shSLPI組、Vector組與SLPI組細胞皮下移植瘤生長情況比較[a為皮下移植瘤照片；b為皮下移植瘤瘤重（g）比較；*P＜0.05]

3 討論

卵巢癌是目前全球女性癌癥相關死亡的第八大原因，全球每年約有14萬名女性死于卵巢癌[6]。探討卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及其轉移過程，尋找調控這些過程的關鍵信號蛋白，針對性地研究基因靶向治療，是推進臨床上卵巢癌診治水平關鍵的環(huán)節(jié)。

SLPI是一種中性白細胞彈性蛋白酶抑制劑，其主要功能是抗蛋白酶和抗炎活性，保護正常黏膜組織免受來自絲氨酸蛋白酶如彈性蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等的降解作用。多項臨床研究結果顯示，SLPI在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及結直腸癌等多種癌癥中呈高表達狀態(tài)，且其高表達與腫瘤患者的預后不良呈正相關[7-8]。本研究通過構建不同SLPI表達水平的卵巢癌細胞株，并比較其增殖、凋亡、侵襲、遷移等細胞生物學行為發(fā)現(xiàn)，SLPI高表達可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡并促進體內腫瘤生長，同時此結果在敲低細胞株中得到驗證。

迄今未止，關于SLPI基因對卵巢腫瘤的影響相關研究不多。Carlson等[9]研究表明與卵巢良性疾病相比，上皮性卵巢癌患者卵巢組織中SLPI表達顯著升高，并且有望成為用于卵巢癌診斷的新的腫瘤標志物。Rasool等[10]研究表明耐藥性卵巢癌細胞株中SLPI蛋白表達上調，紫杉醇暴露可上調卵巢癌細胞株中SLPI蛋白表達，并促進卵巢癌細胞耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)SLPI在正常卵巢上皮細胞中表達水平明顯低于卵巢癌細胞。而進一步細胞實驗結果顯示SLPI過表達促進了SKOV3細胞增殖，SLPI敲降則抑制其增殖。Western blot結果顯示SLPI過表達促進了SKOV3細胞中增殖相關蛋白PCNA和Cyclin D1的表達，SLPI敲降則抑制其表達。有研究也證實SLPI可以通過促進增殖信號蛋白Cyclin D1的表達，或者抑制胰島素樣生長因子結合蛋白 3（insulin like growth factor binding proteins 3,IGFBP-3）的表達促進腫瘤細胞增殖[11-12]。流式檢測術檢測細胞凋亡結果發(fā)現(xiàn)，SLPI過表達抑制了SKOV3細胞凋亡，敲降則促進了SKOV3細胞凋亡。同樣的，蛋白表達檢測發(fā)現(xiàn)，SLPI過表達抑制了凋亡正相關蛋白BAX、Cleaved Caspase-9的表達，而抑制了凋亡負相關蛋白BCL2的表達，SLPI敲降結果則與之相反。以上結果表明，SLPI可以通過促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡起促癌基因作用。轉移是導致卵巢癌患者死亡的主要原因。SLPI直接抑制彈性蛋白酶及其他絲氨酸蛋白酶，調節(jié)MMP、纖溶酶原活性及纖溶酶下游靶向蛋白，從而影響腫瘤細胞侵襲[13]。關于胃癌的研究證明SLPI通過Elk-1信號通路促進MMP-2/9的表達從而促進腫瘤細胞遷移。以上研究表明SLPI可能通過影響腫瘤的增殖、遷移過程影響了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究過表達和敲降SLPI后檢測其對SKOV-3細胞遷移和侵襲能力影響時也發(fā)現(xiàn)，SLPI過表達促進SKOV-3的遷移和侵襲，SLPI敲降則抑制了SKOV3的遷移和侵襲。且過表達促進了遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9及Snail1、Slug的表達，敲降則相反。證明SLPI在腫瘤中發(fā)揮促腫瘤轉移作用。而MMP-2、MMP-9、Snail1及Slug等蛋白與腫瘤細胞上皮間質轉化密切相關，提示SLPI可能還可以通過調控腫瘤細胞的其他生物學功能影響腫瘤進程，值得更深入的研究。此外，裸鼠皮下成瘤實驗證實了SLPI過表達可促進腫瘤體內增長，而敲低則抑制了腫瘤的增長，SLPI組裸鼠的移植瘤瘤重明顯高于對照組，而SLPI敲降則相反。

綜上所述，SLPI高表達促進卵巢癌的增殖、遷移和侵襲能力，同時抑制細胞凋亡，在體內卵巢癌惡性進程中發(fā)揮著促癌的作用。關于SLPI如何調控卵巢癌細胞增殖和遷移，則需要進一步探討。