利用漸滲系解析黃瓜心皮數(shù)基因CsCLAVATA3調(diào)控果實(shí)發(fā)育的多效性

高 陽(yáng)，劉 娟，劉一諾，侯非凡，王金耀，邢國(guó)明，李 森

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/山西省設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷，030801）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是世界上重要的蔬菜經(jīng)濟(jì)作物，提高單位面積的產(chǎn)量一直是黃瓜育種最重要的目標(biāo)之一。黃瓜心皮數(shù)增多可以顯著提高果實(shí)單果重［1］，在生產(chǎn)上有著極為重要的意義。

葫蘆科的果實(shí)大小和性狀可能受到果實(shí)心皮數(shù)（Carpel Number, CN）的影響［2］。CN變異的分子和遺傳機(jī)制已經(jīng)在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中進(jìn)行了廣泛的研究，擬南芥CLAVATA途徑主要包括3個(gè)基因（CLV1,CLV2和CLV3），任何一種基因的缺陷都可能會(huì)表現(xiàn)出花和花器官數(shù)量增加［3］；在番茄中果實(shí)大小的變化也是由于CLV3同 源基因fasciated(fas)以及WUSCHEL同源基因locule number(lc)所引起的［4-6］，其對(duì)室數(shù)和果實(shí)大小有著協(xié)同效應(yīng)［7］；在甜瓜中，心皮數(shù)是由pentamerous(p)基因控制的，其研究表明5心皮甜瓜要比3心皮甜瓜更圓［8-10］。在黃瓜中，Li等人確定了CsCLV3是導(dǎo)致黃瓜心皮數(shù)目變化的原因，并且提出黃瓜品系果實(shí)重量的增加可能是由于Cn位點(diǎn)增加的多效性效應(yīng)［1］?？傮w來(lái)看，CLV3在植物中所表現(xiàn)出的遺傳效應(yīng)是一致的。

本研究在張亞楠等［11］的基礎(chǔ)上，利用其使用輪回母本‘長(zhǎng)春密刺’與輪回父本‘True Lemon’構(gòu)建的BC3F1，進(jìn)一步自交得到純合自交系，進(jìn)行漸滲片段分析、表型差異分析以及數(shù)量性狀基因座定位（Quantitative Trait Locus, QTL）分析，以期明確黃瓜心皮數(shù)基因CsCLV3在調(diào)控果實(shí)發(fā)育上所顯示的多效性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)中CsCLV3近等基因系NIL(TL)構(gòu)建所用輪回母本‘長(zhǎng)春密刺’（CCMC）為華北型黃瓜骨干親本，輪回父本‘True Lemon’（TL）來(lái)自于美國(guó)威斯康辛大學(xué)黃瓜分子遺傳與育種實(shí)驗(yàn)室［12,13］（圖1）。將CCMC/TL雜交產(chǎn)生的F1與輪回親本CCMC回交3代得到BC3F1［11］，在此基礎(chǔ)上篩選候選單株并自交1次得到本試驗(yàn)所用BC3F2群體。

圖1 黃瓜CsCLV3漸滲系輪回親本CCMC和TLFig.1 Recurrent parents CCMC and TL of cucumber CsCLV3 osmotic lines

1.2 田間試驗(yàn)和性狀考察

310個(gè)BC3F2單 株 于2019年 夏 天 在 山 西農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 站 種 植（北 緯37°25′20″，東 經(jīng)112°34′50″）。從BC3F2單株采取幼嫩葉片，使用改良CTAB法抽提DNA［14］，供心皮數(shù)關(guān)聯(lián)標(biāo)記D1及多態(tài)性SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記進(jìn)行基因型分型［1］。5月10日催芽，5月20日移栽，種植密度為40 cm × 60 cm，田間管理采取一般大田管理。

在果實(shí)的整個(gè)發(fā)育周期中，對(duì)心皮數(shù)（Carpel Number, CN）、果實(shí)長(zhǎng)度（Fruit Length, FL）、果實(shí)粗度（Fruit Diameter, FD）、成熟單瓜重量（Fruit Weight, FW）、種子數(shù)（Seed Number, SN），種子百粒重（Hundred-grain Weight, HGW）等農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定。其中FD測(cè)量距離瓜頂三分之一處即瓜肚位置，各性狀測(cè)定參考見(jiàn)圖2。將雌花完全打開(kāi)的時(shí)間定義為0 d，則果實(shí)發(fā)育時(shí)間為-6～40 d，每日早晨8時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量，3次重復(fù)。每個(gè)單株上所有果實(shí)的表型平均值作為該單株的表型值。數(shù)據(jù)集選用果實(shí)40 d時(shí)的各性狀表型值，使用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、GraphPad prism 8.0作圖，顯著性分析所用軟件為DPSv7.05版。

圖2 果實(shí)農(nóng)藝性狀測(cè)定示意圖Fig.2 Schematic diagram for determination of agronomic characters of fruit

1.3 漸滲片段分析

1.3.1 SSR 分析 課題組前期基于Yang等發(fā)表的黃瓜基因組連鎖遺傳圖譜［15］篩選出了在CCMC與TL間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記95對(duì)，這些標(biāo)記均勻分布于黃瓜的7條染色體中，CsCLV3的圖位克隆結(jié)果表明其位于1號(hào)染色體上［1］，根據(jù)Weng等發(fā)表的Gy14-V2物理圖譜(ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/cucumber/Gy14/V2/)，對(duì) 目 標(biāo)基因周圍進(jìn)行SSR加密，檢測(cè)5心皮純合型與3心皮純合型以及輪回親本間的多態(tài)性。PCR采用10 μL擴(kuò)增體系，touchdown反應(yīng)程序［11］，采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后經(jīng)銀染顯色拍照記錄檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)導(dǎo)入系中的標(biāo)記基因型是否與CCMC相同確定導(dǎo)入系在標(biāo)記位點(diǎn)上是否攜帶供體親本的導(dǎo)入片段，并利用GGT32構(gòu)建圖示基因型［16］。

1.3.2 SNP 分析 在BC3F2群體中選擇基因型數(shù)據(jù)與心皮數(shù)表型鑒定數(shù)據(jù)相一致的植株，即基因型數(shù)據(jù)為A、心皮數(shù)為3的3心皮子代與基因型數(shù)據(jù)為B、心皮數(shù)為5的5心皮子代，2種材料各選5株進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（Genotyping-By-Sequencing,GBS），利用北京百邁客生物科技有限公司自主 研 發(fā) 的SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技術(shù)［17］對(duì)10個(gè)子代進(jìn)行酶切測(cè)序，以黃瓜Gy14-V2基因組作為參考基因組，利用BWA［18］將測(cè)序reads比對(duì)到參考基因組上，并使用GATK［19］和Samtools［20］2種方法開(kāi)發(fā)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single Nucleotide Polymorphism,SNP），最終取2個(gè)軟件所得結(jié)果的交集。將得到的各材料高質(zhì)量SNP分別存儲(chǔ)在EXCEL文件中，并使用LOOKUP公式篩選差異SNP［12］，最終得到5個(gè)5心皮材料相對(duì)于3心皮SNP組的差異SNP以及5個(gè)3心皮材料相對(duì)于5心皮SNP組的差異SNP。使用R/CMplot包［21］繪制5心皮純合型以及3心皮純合型的差異SNP密度分布圖，以差異SNP所在物理位置來(lái)判斷其導(dǎo)入片段長(zhǎng)度。

1.4 QTL定位

利用141個(gè)單株BC3F2群體（不含雜合基因型個(gè)體）和CsCLV3所在1號(hào)染色體上的多態(tài)性SSR標(biāo)記，構(gòu)建CsCLV3局部區(qū)間的分子標(biāo)記連鎖圖，利用R / qtl軟件［22］中的em算法對(duì)黃瓜6個(gè)果實(shí)性狀CN、FL、FD、FW、SN以及HGW進(jìn)行QTL定位。使用MapQTL 6.0區(qū)間作圖法（Interval Mapping,IM）對(duì)定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并計(jì)算加性效應(yīng)及遺傳貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 漸滲片段分析

2.1.1 基于多態(tài)性SSR標(biāo)記的漸滲分析 在CCMC/ TL群體，BC3F1回交世代中，4號(hào)、5號(hào)染色體遺傳背景恢復(fù)率達(dá)到100%，2號(hào)、3號(hào)、7號(hào)染色體恢復(fù)率也達(dá)到了99%［11］，所以在本研究中重點(diǎn)關(guān)注了BC3F2子代在1號(hào)、6號(hào)染色體上的遺傳背景恢復(fù)（圖3），可以看到，在1號(hào)染色體上，10個(gè)5心皮子代均在染色體前端有著不同長(zhǎng)度的供體片段，在0～10.8 Mb區(qū)間內(nèi)，其滲入片段可以分成兩部分，共有片段為UW084475(8.2 Mb) - D1(10.8 Mb)，在UW085383(0.2 Mb) - UW028617(8.0 Mb)區(qū)間內(nèi)，5心皮子代滲入片段在個(gè)體間存在差異；10個(gè)3心皮子代均不含有D1標(biāo)記附近供體片段，說(shuō)明此片段在決定5心皮發(fā)育上起到了關(guān)鍵作用，3心皮子代在UW028419(7.7 Mb) - UW028617(8.0 Mb)以及UW046836(8.4 Mb)周圍存在2個(gè)小片段。在6號(hào)染色體上，滲入片段并沒(méi)有隨著心皮的變化而變化，5 心皮子代 B3、B6 在 Chr_6 上的遺傳背景恢復(fù)率達(dá)到了100%，而其余5心皮子代有著不同大小的滲入片段，3心皮子代A1、A7、A8、A9遺傳恢復(fù)率較高，只在UW039897(20.6 Mb) 周圍存在純和或者雜合小片段，剩余3心皮子代在SSR02021(1.0 Mb)- UWSTS0225(7.8 Mb)內(nèi)存在純合或者雜合供體片段。也就是說(shuō)6號(hào)染色體上滲入的供體片段是隨機(jī)的，不影響對(duì)于CsCLV3的遺傳效應(yīng)分析。從全基因組水平來(lái)看，漸滲結(jié)果較好，3心皮近等基因系與5心皮近等基因系只在目的基因?qū)雲(yún)^(qū)域（1號(hào)染色體）以及6號(hào)染色體前端存在差異，背景噪音較小，有利于接下來(lái)的表型比較。

圖3 親本與部分5心皮、3心皮子代在1號(hào)、6號(hào)染色體上的SSR基因分型Fig.3 SSR genotype of parents and some 5-carpels and 3-carpels progenies on chromosomes 1 and 6

2.1.2 基于GBS的漸滲分析 基于RsaI + HaeII雙酶切策略，本試驗(yàn)測(cè)序的10個(gè)單株共獲得148 626個(gè)SLAF標(biāo)簽，標(biāo)簽的平均測(cè)序深度為20.30 X，在染色體上分布均勻，在此基礎(chǔ)上將clean data比對(duì)到參考基因組Gy14-V2，SNP Calling后共得到9 594個(gè)群體SNP，其中5個(gè)5心皮純合型子代為5 469個(gè)，5個(gè)3心皮純合型子代為4 125個(gè)。篩選每個(gè)5心皮純合型單株相對(duì)于3心皮純合型SNP集合的差異SNP以及每個(gè)3心皮純合型單株相對(duì)于5心皮純合型SNP集合的差異SNP，最終獲得5心皮純合型差異SNP共2 797個(gè)，3心皮純合型差異SNP共2 097個(gè)。

按照其差異SNP所在物理圖譜的位置，篩選1號(hào)及6號(hào)染色體上的標(biāo)記，繪制得到圖4所示SNP密度分布圖。5心皮純合型子代差異SNP主要集中于1號(hào)染色體前端，B1、B2、B3、B4這4個(gè)單株在1號(hào)染色體10.8 Mb周圍表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的SNP分布，B2單株SNP密度要低于另外4株，而5株3心皮純合型子代（A1-A5）在1號(hào)染色體上SNP很少。在6號(hào)染色體上SNP的分布并沒(méi)有隨心皮數(shù)目的變化而變化，滲入片段是隨機(jī)的，A2、A3、A4、B1在6號(hào)染色體上的SNP密度較高?？傮w來(lái)看SNP差異分析與SSR分析的結(jié)果一致。漸滲結(jié)果較好。

圖4 子代差異SNP在染色體上的密度分布圖Fig.4 Density distribution map of offspring differential SNP sets on chromosomes

2.2 BC3F2群體6個(gè)果實(shí)性狀分析

2.2.1 表型在群體中的頻數(shù)分布 本試驗(yàn)利用黃瓜心皮數(shù)基因CsCLV3關(guān)聯(lián)標(biāo)記D1對(duì)BC3F2世代310株單株進(jìn)行了前景選擇，結(jié)果表明，其中79株為3心皮純合型，68株為5心皮純合型，其余163株為雜合型。經(jīng)卡方檢驗(yàn)得χ2= 1.606 5（1∶2∶1），在P＜ 0.05水平，當(dāng)df = 2時(shí)χ2標(biāo)準(zhǔn)值為5.99，符合孟德?tīng)柗蛛x定律。在此基礎(chǔ)上剔除雜合型以及生長(zhǎng)不良單株，最終75株3心皮純合型以及66株5心皮純合型應(yīng)用于大田表型調(diào)查。

6個(gè)果實(shí)性狀的表型值頻率分布都呈現(xiàn)雙峰分布（圖5，A-F），其雙峰低谷值依次為4.2、34.5 cm、5.7 cm、180粒、390 g和2.15 g，2種基因型的表型值分布于雙峰低谷值兩側(cè)。在心皮數(shù)方面，3心皮純合型單株大部分表現(xiàn)為3心皮，有少數(shù)單株會(huì)存在3心皮果實(shí)與4心皮果實(shí)同時(shí)存在的情況，而5心皮純合型則大多表現(xiàn)為5心皮，少數(shù)單株存在4心皮果實(shí)、5心皮果實(shí)以及6心皮果實(shí)同時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象；同時(shí)發(fā)現(xiàn)5心皮純合型單株的果實(shí)，有著較短的果實(shí)長(zhǎng)度、較粗的果實(shí)粗度、果實(shí)重量增大、種子數(shù)目變多以及種子粒徑變小導(dǎo)致的百粒重減少情況。因此，這個(gè)近等基因系BC3F2群體的果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)粗度、果實(shí)重量、種子數(shù)目以及百粒重都是由于心皮數(shù)目變化所引起的，也就是說(shuō)，其變異是由心皮數(shù)基因CsCLV3調(diào)控果實(shí)發(fā)育的多效性所導(dǎo)致的。

圖5 BC3F2群體中純合基因型單株果實(shí)性狀頻數(shù)分布Fig.5 Frequency distribution of fruit traits per plant with pure genotype in BC3F2 population

2.2.2 果實(shí)性狀間的相關(guān)性分析 為了更加明確6個(gè)果實(shí)性狀間的互作關(guān)系，進(jìn)一步分析了它們之間的相關(guān)性（表1）。

表1 果實(shí)性狀間的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient among fruit characters

可以看到，性狀兩兩之間都表現(xiàn)為極顯著相關(guān)，其中果實(shí)粗度與單瓜重量的相關(guān)性最高，為0.99，果實(shí)長(zhǎng)度與單瓜重量的相關(guān)性系數(shù)為-0.40，說(shuō)明在相同條件下果實(shí)粗度增加對(duì)重量的增效程度要遠(yuǎn)高于果實(shí)長(zhǎng)度增加對(duì)其的影響，心皮數(shù)與果實(shí)粗度的相關(guān)性達(dá)到了0.93，間接說(shuō)明了心皮數(shù)目增加對(duì)于提高黃瓜果實(shí)單果重具有重要意義。另外，心皮數(shù)與其余4個(gè)性狀也表現(xiàn)出了較高的相關(guān)性，分別為- 0.72、0.93、0.89、0.91、-0.94，也說(shuō)明了心皮數(shù)基因CsCLV3調(diào)控果實(shí)發(fā)育的多效性。2.2.3 黃瓜心皮數(shù)基因CsCLV3調(diào)控果實(shí)發(fā)育的多效性 比對(duì)6個(gè)果實(shí)性狀在兩種基因型上的差異可以發(fā)現(xiàn)（表2），5心皮純合型的CN比3心皮純合型多1.8，F(xiàn)D比3心皮純合型粗1.05 cm，F(xiàn)W比3心皮純合型重48.57 g，種子數(shù)平均比后者多103.01粒，而FL與HGW分別比3心皮純合型低3.2 cm和0.74 g。黃瓜心皮數(shù)基因CsCLV3通過(guò)調(diào)控黃瓜心皮數(shù)目的多少進(jìn)而對(duì)一系列的果實(shí)性狀產(chǎn)生多效性影響，表明CsCLV3對(duì)果實(shí)6個(gè)性狀有較大的遺傳效應(yīng)。

表2 3心皮純合型與5心皮純合型果實(shí)性狀統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of fruit characters of 3 - carpels pure type and 5 - carpels pure type

2.3 果實(shí)6個(gè)性狀QTL定位

利用BC3F2群體141個(gè)單株的6個(gè)果實(shí)性狀CN、FL、FD、FW、SN和HGW的表型值，結(jié)合已經(jīng)構(gòu)建好的黃瓜1號(hào)染色體CsCLV3局部遺傳連鎖圖譜進(jìn)行QTL分析（圖6、表3）。6個(gè)果實(shí)性狀均定位到心皮數(shù)基因位置，LOD峰值落在心皮數(shù)基因關(guān)聯(lián)標(biāo)記D1位點(diǎn)，R / qtl與MapQTL計(jì)算結(jié)果一致，其中CN性狀LOD值最高，為93.3，解釋了心皮數(shù)目變異的95.3%。果實(shí)重量的加性效應(yīng)達(dá)到-24.29 g，種子數(shù)目的加性效應(yīng)達(dá)到了-51.50粒，表型變異幅度較大，種子數(shù)目QTL解釋了其變異的87.9%，其余表型性狀FL、FD、FW、HGW，對(duì)應(yīng)QTL分別能解釋其表型變異的55.2%、89.7%、83.2%、93.9%。

圖6 BC3F2群體6個(gè)果實(shí)性狀的QTL峰值曲線Fig.6 QTL peak curve of six fruit traits in BC3F2 population

表3 BC3F2群體6個(gè)果實(shí)性狀的QTL定位Table 3 QTL mapping of six fruit traits in BC3F2 population

3 討論與結(jié)論

本研究基于正向遺傳學(xué)的思路，通過(guò)構(gòu)建心皮數(shù)基因CsCLV3近等基因系來(lái)進(jìn)一步探索其調(diào)控果實(shí)發(fā)育的多效性。近等基因系的好處在于其與受體親本之間只有代換片段的差異，這樣可以減少非目的基因?qū)τ谠囼?yàn)結(jié)果的影響，在抗性育種方面，Jena等通過(guò)構(gòu)建25個(gè)水稻近等基因系為抗褐飛虱育種提供了新的遺傳資源［23］；在QTL定位方面，Guan等利用多個(gè)近等基因系精確定位并驗(yàn)證了小麥染色體4AL上控制其千粒重的主效數(shù)量性狀基因座［24］；在基因功能研究方面，Glagoleva等應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合分析的方法，利用大麥近等基因系，闡明了其黑外種皮基因的代謝途徑及遺傳效應(yīng)［25］。本研究利用5心皮黃瓜‘True Lemon’以及3心皮黃瓜‘CCMC’構(gòu)建了黃瓜心皮數(shù)近等基因系，用于自交的BC3F1世代遺傳背景大約98%是純和CCMC［11］，背景噪音較小，SSR分析與SNP分析也證實(shí)了這一點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上得到的BC3F2群體能夠準(zhǔn)確地判斷心皮數(shù)基因CsCLV3對(duì)于果實(shí)發(fā)育的效應(yīng)。

通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇可以極大的加快常規(guī)育種進(jìn)程，Wang等使用MAS策略將高抗褐飛虱基因?qū)胨緝?yōu)良品種9311，育成高抗近等基因系［26］；Kang等使用MAS加速了抗條紋葉枯病近等基因水稻品系的構(gòu)建［27］；譚聰?shù)仁褂靡粋€(gè)BC2F2群體對(duì)Ghd7調(diào)控水稻劍葉面積的多效性進(jìn)行了一系列研究，在判斷BC2F2群體基因型時(shí)必須依靠BC2F2:3家系才能夠?qū)ι弦皇来蛐妥龀雠袛啵?8］。本研究基于前期開(kāi)發(fā)的心皮數(shù)關(guān)聯(lián)標(biāo)記D1［1］以及多態(tài)性SSR標(biāo)記［11］，可以快速的進(jìn)行前景選擇和背景選擇，在BC3F2群體尚在幼苗時(shí)期就可以對(duì)其基因型以及遺傳背景做出鑒定，只保留了群體中的3心皮子代以及5心皮近等基因系，過(guò)濾掉了雜合型單株，節(jié)省了人力物力。

葫蘆科果實(shí)的大小、形狀可能受到植物性別表達(dá)以及果實(shí)心皮數(shù)（CN）的影響［2］，在本研究中，構(gòu)建CsCLV3近等基因系的過(guò)程中已經(jīng)排除掉了黃瓜兩性花位點(diǎn)（m位點(diǎn)）［29］，BC3F2群體中3心皮純合系與5心皮純合系只有心皮數(shù)位點(diǎn)（Cn位點(diǎn)）上的差異。6個(gè)果實(shí)性狀的表型值均呈現(xiàn)為雙峰分布，這符合F2群體中表型數(shù)據(jù)的分布特征，證明了表型數(shù)據(jù)的可靠性，其中3心皮純合型與5心皮純合型在各性狀都存在著很明顯的差異。心皮數(shù)目與果實(shí)粗度（r = 0.93，P＜ 0.01）、單瓜重量（r = 0.89，P＜ 0.01）、種子數(shù)目（r = 0.91，P＜ 0.01）這3個(gè)性狀均為極顯著正相關(guān)，與果實(shí)長(zhǎng)度（r = -0.72，P＜ 0.01）、百粒重（r = -0.94，P＜ 0.01）這2個(gè)性狀極顯著負(fù)相關(guān)，這與Pan等的描述一致，CN較高的植株表現(xiàn)出略低的FL，以及較高的FD，F(xiàn)D表型的變異可以歸因于Cn位點(diǎn)的多效性效應(yīng)［2］。當(dāng)心皮數(shù)目增加時(shí)，其果實(shí)內(nèi)部腔室增多，用于供給種子養(yǎng)分的側(cè)膜胎座空間增加，致使種子數(shù)量增多，也正是由于這種發(fā)育情況，種子粒徑變小，其百粒重下降。

在QTL定位方面，本研究中的6個(gè)果實(shí)性狀均定位到了心皮數(shù)關(guān)聯(lián)標(biāo)記D1上，CN、FL、FD、FW、SN和HGW對(duì)應(yīng)QTL貢獻(xiàn)率分別為95.3%、87.9%、55.2%、89.7%、83.2%、93.9%，解釋變異的程度都比較高。

性狀間的相關(guān)性以及QTL定位的結(jié)果都說(shuō)明了這6個(gè)性狀的變異是由Cn基因座引起的心皮數(shù)目變化所導(dǎo)致的，這些變異也與心皮數(shù)基因CsCLV3共分離。