河北保定地區(qū)草莓根腐病病原鑒定及室內(nèi)毒力測定

李青杰，朱佳紅，吳佳佳，靳 茜，李 園，顏冬冬，王秋霞，曹坳程

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，北京 100193；2.保定學院/河北省土傳病害綠色防控技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

草莓 (Fragaria ananassaDuchense) 是薔薇科草莓屬、多年生宿根性草本植物，具有較高的經(jīng)濟價值，因其營養(yǎng)豐富、酸甜多汁，素有“水果皇后”的美稱［1-2］。近年來草莓的種植面積不斷擴大，連作導致的土傳病害也越來越嚴重，尤其是草莓根腐病，嚴重制約了草莓種植業(yè)的發(fā)展，影響了草莓的產(chǎn)量和收益［3］。

草莓根腐病在冬季和早春發(fā)病較為嚴重，嚴重影響草莓的生產(chǎn)，主要為害草莓的根系，一般表現(xiàn)為全株系統(tǒng)性為害癥狀，根據(jù)為害癥狀和病原菌的不同，草莓根腐病可分為炭疽根腐病、紅中柱根腐病和黑根腐?。?］。草莓根腐病在世界各地均有不同程度的發(fā)生，但不同地區(qū)草莓根腐病的病原菌種類不同［5］。我國北京、山東、安徽、河南和江蘇等地曾報道過草莓根腐病的致病菌，包括鐮刀菌屬、絲核菌屬、擬盤多毛孢屬和疫霉屬等，其中鐮刀菌屬致病菌的報道較多［6-7］。

目前草莓根腐病的防治主要以化學防治為主，可選用代森錳鋅和苯醚甲環(huán)唑等防治草莓炭疽根腐病，選用甲霜靈和霜脲·錳鋅等防治草莓紅中柱根腐病，選用多菌靈、百菌清和吡唑醚菌酯等防治草莓黑根腐?。?］。采取生物防治研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌和乳芽孢桿菌等生防細菌可以防治由尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和膠孢炭疽菌引起的草莓根腐病［9-10］。目前，采取無菌苗繁殖培育和對土壤進行消毒也是預防草莓根腐病的有效措施。

河北省保定市是全國重要的草莓種植基地，草莓種植已有多年的時間［11］。然而連作地塊草莓根腐病發(fā)病嚴重，危害草莓的生長發(fā)育，導致大幅減產(chǎn)，給農(nóng)民帶來了巨大的損失［12］。而目前關(guān)于保定地區(qū)草莓根腐病的具體致病菌報道較少，為研究該地區(qū)草莓根腐病的主要致病菌，將采集到的草莓根腐病株進行病原菌分離純化和柯赫氏法則驗證，并對鑒定的病原真菌進行室內(nèi)毒力測定，旨在為防治該地區(qū)草莓根腐病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株 草莓根腐病病樣于2020年11至12月采集于河北省保定市滿城區(qū)南韓村鎮(zhèn)段旺村、順平縣蒲陽鎮(zhèn)東魏村、順平縣腰山鎮(zhèn)才良村等主要草莓種植基地（連續(xù)種植草莓20年以上），分為“紅顏”和“甜查理”2個品種。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司。PDA成分：馬鈴薯浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂14.0 g，pH為（5.6 ± 0.2）。加入1 000 mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，分裝，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.1.3 供試藥劑 10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑，25%吡唑醚菌酯懸浮劑，3%甲霜·噁霉靈水劑（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）；50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇三山農(nóng)藥有限公司）；50%克菌丹可濕性粉劑（安道麥馬克西姆有限公司）；50%福美雙可濕性粉劑（河北冠龍農(nóng)化有限公司）；722 g/L霜霉威鹽酸鹽水劑（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司）；50%異菌脲可濕性粉劑（蘇州富美實植物保護劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用常規(guī)的組織分離方法［13-14］進行分離：用流動的清水沖洗干凈草莓的根部。剖開草莓褐色的根部，切取病健交接處0.5 cm左右的組織塊，放入75%的酒精中浸泡30 s，轉(zhuǎn)入無菌水中清洗3次，用滅菌紙吸干水分后用鑷子將其置于含有0.1 g/L硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上, 放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲, 單孢純化, 分離得到的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學鑒定 觀察接種到PDA培養(yǎng)基上的病原菌菌絲形態(tài)變化、顏色等生長情況。在顯微鏡下拍照觀察，觀察記錄菌落的分生孢子形態(tài)和菌絲形態(tài)等。

1.2.3 病原菌分子鑒定 采用CTAB法提取純化菌株 的DNA。用 真 菌ITS通 用 引 物ITS1 (5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′)對分離菌株DNA進行PCR擴增。PCR體系為20 μL體系：DNA模板2 μL，M5Hiper超光速mix 10 μL，ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL，dd H2O補足至20 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 60 s，共36個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結(jié)果采用BLAST進行同源性分析。最后使用軟件MEGA 7.0以最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 致病性測定 根據(jù)柯赫氏法則［15］，將分離得到的菌株接種到草莓植株上，接種無菌水的草莓植株為對照，觀察草莓植株的發(fā)病情況。從發(fā)病的草莓植株上重新分離、純化病原菌并進行形態(tài)學和分子鑒定。

1.2.5 殺菌劑對供試病原菌的室內(nèi)毒力測定 用無菌水將供試藥劑溶解配制成一定質(zhì)量濃度的藥劑母液，再用無菌水稀釋，制成系列濃度梯度藥液。將殺菌劑加入PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,制成含藥平板(9 cm)，以加入等量滅菌水的PDA培養(yǎng)基為對照（見表1）。用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取5 mm菌餅接種到培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)。采用菌絲生長速率法［16］測定殺菌劑對供試菌株的毒力作用。應(yīng)用DPS7.5軟件計算出各殺菌劑的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50值、相關(guān)系數(shù)r以及EC5095%置信區(qū)。

表1 殺菌劑母液及有效濃度梯度Table 1 Fungicide mother liquor and effective concentration gradient

抑制生長率（%）= (對照菌落的直徑-處理菌落的直徑)/對照菌落的直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根腐病田間癥狀

在河北省保定市滿城區(qū)南韓村鎮(zhèn)段旺村、順平縣蒲陽鎮(zhèn)東魏村、順平縣腰山鎮(zhèn)才良村等主要草莓種植基地，觀察到草莓病株比健康植株矮小，下部老葉為褐色逐漸向心葉擴展，最后葉片蜷縮，根部為褐色，切開后根莖的中柱均為紅褐色（見圖1）。

圖1 草莓根腐病的發(fā)病癥狀Fig .1 Symptoms of strawberry root rot

2.2 病原菌形態(tài)特征觀察

通過觀察，采集的草莓病株經(jīng)過分離純化菌株特征基本一致。在28 ℃培養(yǎng)條件下，病原菌約14 d長滿9 cm培養(yǎng)皿，菌落呈白色棉狀，邊緣呈波狀，菌落正面未見明顯的色素產(chǎn)生（圖2a），背面為淺黃色，7 d左右出現(xiàn)黑色的顆粒物（圖2b）。在顯微鏡下觀察分生孢子呈紡錘形，直徑為(26.72～31.89) μm × (6.35～8.46) μm。分生孢子有5 個細胞，4 個隔膜，中間3 個細胞顏色較深為橄欖色，頂端與尾部細胞顏色較淡，多數(shù)呈透明狀，頂端2～4 根附屬絲，尾部1 根附屬絲（圖2c）。根據(jù)菌落形態(tài)特征，初步將分離到的菌株鑒定為擬盤多毛孢屬真菌。

圖2 病原菌菌落及分生孢子形態(tài)Fig. 2 Pathogen colony and conidia morphology

2.3 病原菌分子鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR擴增、1%瓊脂凝膠電泳后，病原菌的DNA序列長度在500～750 bp之間。將測序序列進行BLAST比對，菌株的序列和新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）的相似性達到98%，且在進化樹上最接近（圖3）。進一步可確定所采集到的草莓根腐病病株的病原菌為新擬盤多毛孢。

圖3 真菌ITS序列遺傳進化分析Fig 3 Genetic evolution analysis of fungal ITS sequence

2.4 病原菌的致病性

接種病原菌的草莓植株10 d左右可見草莓葉片邊緣變?yōu)闇\褐色，逐漸向內(nèi)擴展，草莓根部也變成褐色，切開草莓根系，內(nèi)部均為褐色，和田間癥狀相同。根據(jù)柯赫氏法則，從接種發(fā)病的草莓根部分離病原菌，進行形態(tài)學和分子鑒定，結(jié)果表明該菌為是新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora），病菌與從田間草莓病株上分離鑒定的病原菌一致。證明用于接種的病原菌是引起該草莓根腐病的病原菌。

2.5 殺菌劑對病原菌的毒力測定

測定結(jié)果顯示吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡囊种菩Ч詈茫珽C50值分別為0.004 8和0.013 6 mg/mL，其次是福美雙、克菌丹和異菌脲，EC50值分別為0.019 7、0.026和0.060 1 mg/mL，甲霜·噁霉靈和多菌靈的效果較差，EC50值分別為0.950 5和0.95 8 mg/mL，霜霉威的抑制效果較差，EC50高達4.003 5 mg/mL（見表2）。

表2 殺菌劑對新擬盤多毛孢的毒力測定結(jié)果Table 2 Toxicity test results of fungicides to Neopestalotiopsis clavispora

3 結(jié)論與討論

草莓的連作導致病原菌和蟲卵的積累，極易發(fā)生病害，其中草莓根腐病已經(jīng)成為草莓生產(chǎn)上難以解決的問題，目前主要以化學防治為主［17］。由于草莓根腐病的致病菌較多，首先要明確具體致病菌才能有針對性的防治草莓根腐?。?8］。

本研究確定了保定地區(qū)草莓主要種植地草莓根腐病的致病菌是新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora），這也是首次在河北保定報道。國外如西班牙、印度、阿根廷等地已報道新擬盤多毛孢可引起草莓根腐和莖腐病［19-21］，我國到目前為止僅在青島和北京發(fā)現(xiàn)新擬盤多毛孢引起的草莓葉斑病和根腐?。?2］，新擬盤多毛孢還可侵染月季和牛油果等作物［23-24］，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失。溫浩等［22］研究表明雙苯菌胺對從草莓葉斑病上分離的新擬盤多毛孢的毒力最強；姚玉榮等［25］發(fā)現(xiàn)戊唑醇對膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病防治效果最好；咸俊男等［26］研究表明，甲基硫菌靈對立枯絲核菌引起的房山區(qū)草莓根腐病有較好的抑制作用；姚錦愛［27］研究表明貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）可有效防治尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病。在本研究供試的8種殺菌劑的毒力測定中，結(jié)果顯示吡唑醚菌酯對新擬盤多毛孢引起的草莓根腐病抑制效果最好，可作為防治草莓根腐病的首選藥劑。

本試驗通過菌株形態(tài)學和分子生物學方法明確了引起保定地區(qū)草莓根腐病的病原菌主要為新擬盤多毛孢 (Neopestalotiopsis clavispora) , 病原菌回接草莓又重新分離鑒定到該病原菌，并測定了8種殺菌劑對病原菌的敏感性，研究結(jié)果為保定地區(qū)草莓根腐病的防治提供了一定的參考依據(jù)。但在田間施藥時，會受到多種因素如溫度、濕度、噴霧器等的影響，可能會與本試驗的研究結(jié)果有所不同。所以本研究的室內(nèi)藥劑毒力測定結(jié)果還需要在田間進一步的驗證。