基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的機(jī)制研究*

宋 健，孟凱強(qiáng)，張振華，張瑞凡，王紫慧，胥 冰，王 斌，沈舒文，楊燕燕

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

細(xì)菌感染是常見的微生物侵體類型，細(xì)菌感染可作為誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)其他疾病的發(fā)生發(fā)展，也可由其他疾病誘發(fā)。關(guān)于細(xì)菌感染的治療也是多種多樣的，常規(guī)的抗生素治療，噬菌體治療等。由于抗生素的濫用，抗生素耐藥性時(shí)常發(fā)生[1-2]，新的治療策略就顯得非常有意義。

越來(lái)越多的臨床數(shù)據(jù)證明傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下的遣方用藥在治療細(xì)菌感染方面療效顯著[3]，蘭艾雙香方是名老中醫(yī)沈舒文教授扎實(shí)的中醫(yī)理論和豐富中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的凝練，多年來(lái)一直作為治療細(xì)菌感染臨床基礎(chǔ)方，其組成有羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭、艾葉，該方臨床中取得了良好的療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology，NP）是以整體性和系統(tǒng)性為特性強(qiáng)調(diào)多成分、多靶點(diǎn)、多疾病之間的相互作用，通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可提高效率，降低開發(fā)成本，也適用于中醫(yī)藥的研究與開發(fā)。作為一項(xiàng)研究手段，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)迅速發(fā)展，形成了一系列成熟的數(shù)據(jù)方法、平臺(tái)和軟件，如中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）可對(duì)中藥成分進(jìn)行篩選、獲取成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系；Gene Cards，OMIM 和 DigSee 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)集成包括基因組、蛋白質(zhì)組、功能信息等資源；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)可以預(yù)測(cè)藥物與蛋白質(zhì)之間相互作用；Cytoscape軟件用于分子互作網(wǎng)絡(luò)及生物途徑可視化；Metascape用于對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等。

1 資料和方法Data and methods

1.1 蘭艾雙香方活性成分的獲取及靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集蘭艾雙香方中羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭和艾葉的化學(xué)成分[4-6]，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為指標(biāo)進(jìn)行篩選，確定其活性成分。通過(guò)TCMSP和Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢活性成分相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并利用Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱，篩選人類的靶點(diǎn)蛋白，最終整理得到蘭艾雙香方的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 細(xì)菌感染靶點(diǎn)篩選預(yù)測(cè) 利用Gene Cards，OMIM和DigSee 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“bacterial infection”為關(guān)鍵詞，對(duì)細(xì)菌感染相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索及篩選，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果合并，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到細(xì)菌感染的相關(guān)靶標(biāo)信息。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用jvenn平臺(tái)做出韋恩圖將所得藥物活性成分靶點(diǎn)與細(xì)菌感染疾病靶點(diǎn)相映射，得到蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將交集得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 3.8.0軟件中的CytoNCA插件對(duì)所得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，借助度中心性（DC）和介度中心性（BC）指標(biāo)進(jìn)行篩選，篩選完成后根據(jù)初篩結(jié)果繼續(xù)篩選大于每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，得到蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)[7-8]。

1.4 GO富集分析與KEGG富集分析 通過(guò)Metascape中對(duì)蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，分別研究蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的主要生物功能與主要信號(hào)通路，其中P＜0.05代表富集結(jié)果顯著，并通過(guò)Metascape制作GO富集分析圖及KEGG富集分析氣泡圖[9-12]。

1.5 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 先分別建立通路、基因相互作用關(guān)系和節(jié)點(diǎn)屬性、基因相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，選取主要的KEGG信號(hào)通路，構(gòu)建蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的“KEGG-基因”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 主要觀察指標(biāo) ①單味藥-活性成分-作用關(guān)鍵化合物成分；②PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊筇m艾雙香方關(guān)鍵蛋白基因；③篩選后關(guān)鍵基因在KEGG和GO富集的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共收集得到蘭艾雙香方的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為指標(biāo)進(jìn)行篩選，得到復(fù)方中共110個(gè)活性化學(xué)成分，羌活（15個(gè)）、獨(dú)活（9個(gè)）、石菖蒲（4個(gè)）、藿香（11個(gè)）、蒼術(shù)（9個(gè)）、丁香（6個(gè)）、薄荷（10個(gè)）、貫眾（7個(gè)）、苦杏仁（19個(gè)）、佩蘭（11個(gè)）和艾葉（9個(gè)）的化學(xué)成分，活性成分的基本信息見表1，相同活性成分對(duì)比見表2。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到蘭艾雙香方中活性成分靶點(diǎn)1 788個(gè)，通過(guò)驗(yàn)證篩選最終確定有效靶點(diǎn)245個(gè)，利用Cytoscape 3.8.0軟件將蘭艾雙香方的復(fù)方活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析整理得到圖1，其中菱形代表作用靶點(diǎn)在中間呈長(zhǎng)方形排列，六邊形為中藥的有效成分，圓形為中藥，具體對(duì)應(yīng)見表3。

圖1 蘭艾雙香方單味藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 蘭艾雙香方中活性化合物基本信息

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 相同活性成分對(duì)比表

表3 蘭艾雙香方網(wǎng)絡(luò)圖物質(zhì)代表符號(hào)

2.2 蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)將以細(xì)菌感染的英文“bacterial infection”為關(guān)鍵詞檢索Gene Cards，OMIM和DigSee 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，整理篩選后獲得細(xì)菌感染的有效靶點(diǎn)1 442個(gè)。將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入jvenn平臺(tái)做出韋恩圖（圖2），即蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的潛在作用115個(gè)靶點(diǎn)。

圖2 韋恩圖

2.3 蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)的篩選 利用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)STRING分析蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的靶點(diǎn)，物種選擇為“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖圖3A，為了更加直觀的展示，將設(shè)置自定義值置信度（“custom value confidence（0.950）”），獲得蛋白相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖圖3B，并隱藏在該網(wǎng)絡(luò)中與其他靶標(biāo)無(wú)互作關(guān)系的靶標(biāo)。

圖3A 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖3B 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 篩選后結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)包含97個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 428條邊，其中平均節(jié)點(diǎn)度值為22.31，見圖4。以節(jié)點(diǎn)度值為評(píng)價(jià)參數(shù)，度值越大說(shuō)明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要，可能在發(fā)揮生物學(xué)功能中起著重要的作用。度值排名前10的靶點(diǎn)為原癌基因c-Jun（Jun）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白 p53（TP53）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、細(xì)胞核因子kp65（RELA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、胱天蛋白酶 8（CASP8）、原癌基因 c-FOS（FOS），這些靶點(diǎn)可能是蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 蛋白模塊篩選分析結(jié)果 通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析得知，紅色區(qū)蛋白模塊代表細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控；藍(lán)色蛋白模塊代表對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、造血正調(diào)控；綠色蛋白模塊代表脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)定位、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)；紫色蛋白模塊代表長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成過(guò)程、長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程、異源代謝過(guò)程。見圖4。

圖4 蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染靶點(diǎn)蛋白互作模塊

2.6 GO富集分析及KEGG通路分析結(jié)果 通過(guò)Metascape共篩選得到 GO 條目 2401個(gè)（P＜0.05），其中生物過(guò)程（Biological processes，BP）條目 2 172個(gè)，分子功能（molecular function，MF）條目 149個(gè)，細(xì)胞組成（cell composition，CC）條目 80個(gè)，分別占 90%，6%，4%，其中生物過(guò)程主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、活性氧的代謝過(guò)程和對(duì)受傷的反應(yīng)等；分子功能主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性和磷酸酶結(jié)合等方面；細(xì)胞組成方面主要涉及膜筏、囊泡腔、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物和細(xì)胞外基質(zhì)等方面。各類別前20的條目見圖5。KEGG通路富集篩選得到324條信號(hào)通路（P＜0.05），其中排名前20的條目見圖6，根據(jù)KEGG繪制的氣泡圖見圖7。根據(jù)KEGG結(jié)果在Cytoscape 3.8.0中繪制了重要靶點(diǎn)通路見圖8。

圖5 蘭艾雙香方活性成分治療活性成分潛在靶點(diǎn)GO生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分富集分析

圖6 蘭艾雙香方活性成分治療細(xì)菌感染潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

圖7 蘭艾雙香方活性成分治療細(xì)菌感染潛在靶點(diǎn)的KEGG通路氣泡圖

圖8 蘭艾雙香方靶點(diǎn)通路圖

3 討論

細(xì)菌感染是致病菌侵入血液循環(huán)系統(tǒng)后進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素和其它代謝產(chǎn)物，所引起的全身急性感染[13]。細(xì)菌感染常合并其他疾病，當(dāng)疾病進(jìn)展過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)菌感染時(shí)，疾病的進(jìn)展將向危重期發(fā)展[14-15]?？咕垢腥镜闹委煂?duì)癌癥、糖尿病和乙型肝炎等疾病尤為重要。扶正祛邪、調(diào)和陰陽(yáng)為主的中醫(yī)理論在感染性疾病的治療中療效顯著，木其爾等[16]總結(jié)論述了中醫(yī)藥對(duì)于重癥腦病的治療實(shí)驗(yàn)研究以及臨床觀察數(shù)據(jù)，得出了中醫(yī)藥治療重癥腦病療效顯著。郜賀等[17]總結(jié)了白長(zhǎng)川教授運(yùn)用中醫(yī)藥治療感染性休克的經(jīng)驗(yàn)。芮慶林等[18]研究發(fā)現(xiàn)中藥對(duì)重癥肺炎發(fā)生細(xì)菌耐藥感染有明顯的干預(yù)作用，可減少耐藥發(fā)生，改善預(yù)后，減少嚴(yán)重并發(fā)癥，減少死亡率，對(duì)于減少重癥肺炎耐藥感染發(fā)生及治療預(yù)后有著積極的臨床意義。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，蘭艾雙香方治療細(xì)菌感染的關(guān) 鍵 基 因 有 Jun、TNF、TP53、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK3、Akt1、CASP8、FOS 等。細(xì)胞因子中的 TNF、IL-6是比較重要的指標(biāo)，在細(xì)菌感染診斷中具有非常重要價(jià)值[19]。蘭艾雙香方的關(guān)鍵基因包含TNF和IL-6，進(jìn)一步證實(shí)了關(guān)鍵基因發(fā)揮抗菌作用的可靠性。Jun基因的作用是識(shí)別并結(jié)合AP-1基序5'-TGA[CG]TCA-3'的轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)被HIPK3磷酸化時(shí)，促進(jìn)NR5A1的活性，從而在cAMP信號(hào)通路刺激后導(dǎo)致類固醇生成基因表達(dá)增加。參與大腸癌（CRC）細(xì)胞中USP28的激活的KRAS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。與結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞中的USP28啟動(dòng)子結(jié)合。TP53是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的感應(yīng)因子，是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的重要因素，與先天性抗病毒免疫、細(xì)胞凋亡及病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄都有關(guān)系[20]。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)代謝作用[20-21]。RELA蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮功能，在細(xì)菌之間高度保守，與大腸埃希菌RelA親緣關(guān)系最近的是福氏志賀菌，其次是柯氏檸檬酸桿菌，其在細(xì)胞生命活動(dòng)中具有重要功能，RelA通過(guò)與核糖體和tRNA的相互作用介導(dǎo)細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，因此RelA是一種重要的翻譯因子[22]。MAPK1和MAPK3是在MAPK/ERK級(jí)聯(lián)中起重要作用的2個(gè)MAPK。它們還參與由激活的KIT和KITLG/SCF發(fā)起的信號(hào)級(jí)聯(lián)。根據(jù)細(xì)胞情況，MAPK/ERK級(jí)聯(lián)通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，翻譯，細(xì)胞骨架重排來(lái)介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、存活和分化。MAPK/ERK級(jí)聯(lián)通過(guò)磷酸化許多轉(zhuǎn)錄因子，在分化細(xì)胞的減數(shù)分裂，有絲分裂和有絲分裂后功能的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中也起作用。此外，MAPK/ERK級(jí)聯(lián)還參與內(nèi)體動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)，包括溶酶體加工和通過(guò)核周再循環(huán)室（PNRC）的內(nèi)體循環(huán)；以及有絲分裂期間高爾基體的破碎。胱天蛋白酶激活級(jí)聯(lián)的大多數(shù)上游蛋白酶負(fù)責(zé)TNFRSF6/FAS介導(dǎo)的和TNFRSF1A誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。結(jié)合銜接子分子FADD會(huì)將其募集至任一受體，所得的稱為死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）的聚集體執(zhí)行CASP8蛋白水解激活。然后將活性二聚酶從DISC中釋放出來(lái)，并釋放以激活下游的凋亡蛋白酶。N末端前肽的蛋白水解片段（稱為CAP3，CAP5和CAP6）可能保留在DISC中。切割并激活CASP3，CASP4，CASP6，CASP7，CASP9 和 CASP10?？赡軈⑴c了GZMB的凋亡途徑。FOS是一種原癌基因，在正常人類細(xì)胞中可檢測(cè)到極低水平的表達(dá)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖活化有關(guān)[23]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究過(guò)程中能夠解決一些問題[24]，但也存在一定的缺陷，比如主要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，通過(guò)參數(shù)的設(shè)定來(lái)對(duì)成分進(jìn)行篩選，但這些數(shù)據(jù)庫(kù)可能還有待完善，而參數(shù)值的確定目前也尚有爭(zhēng)論。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蘭艾雙香方的研究我們得到以下科研結(jié)果：①篩選得到蘭艾雙香方共110個(gè)藥效成分和1 788個(gè)作用靶點(diǎn)，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、腫瘤壞死因子和表皮生長(zhǎng)因子受體等；②細(xì)菌感染相關(guān)靶點(diǎn)1 442個(gè)；③蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)共97個(gè)蛋白，分析得到4個(gè)蛋白模塊；④獲得2 401個(gè)GO生物過(guò)程，KEGG通路富集篩選得到324條相關(guān)信號(hào)通路，通路類型包括癌癥的路徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、利什曼病、HIF-1信號(hào)通路、軍團(tuán)桿菌病等，這些通路均與細(xì)菌感染的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；⑤結(jié)果證實(shí)，蘭艾雙香方可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖與凋亡、脂代謝等多種途徑達(dá)到治療細(xì)菌感染的目的，是多成分、多靶點(diǎn)和多通路相互作用的結(jié)果。

蘭艾雙香方是沈舒文教授基于中醫(yī)“正氣存內(nèi)，邪不可干”理論，針對(duì)細(xì)菌感染的“濕熱”特性[24]組建的復(fù)方，方劑由羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、佩蘭、艾葉10味中藥組成，以芳香類藥物為主，佐以發(fā)汗解表，使外邪透表而出。藿香[25]味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，芳香化濕，醒脾開胃；薄荷[26]味辛，性涼入肺、肝經(jīng)，疏散風(fēng)熱，清利頭目，利咽透疹，疏肝行氣，二藥共為君藥，行芳香化濕，解表透邪之效。羌活味辛、苦，性溫，入膀胱、腎經(jīng)，解表散寒，祛風(fēng)勝濕；獨(dú)活味辛、苦，性微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，祛風(fēng)除濕，通痹止痛；石菖蒲味辛，性溫。歸心、胃經(jīng)，祛痰開竅，化濕開胃，寧神益智，3藥共為臣藥，助君藥化濕之功。丁香，貫眾，苦杏仁，佩蘭，艾葉共為佐藥，輔助君臣行祛濕化濁之效。

對(duì)于名老中醫(yī)沈舒文教授臨床常用經(jīng)驗(yàn)方蘭艾雙香方，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究[27]，發(fā)現(xiàn)蘭艾雙香方對(duì)于癌癥、糖尿病、乙型肝炎等疾病并發(fā)細(xì)菌感染的治療具有良好的療效，尤其是以癌癥進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)菌感染。通過(guò)對(duì)蘭艾雙香方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證蘭艾雙香方臨床療效的科學(xué)性，為蘭艾雙香方的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供了科學(xué)依據(jù)。