基于分子網(wǎng)絡(luò)的半枝蓮-白花蛇舌草治療胃癌的多尺度作用機(jī)制研究*

徐 緣，丁 然，騫珊娜，馮 杰，姚 娟，王景輝

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012）

胃癌（gastric carcinoma，GC）逐漸成為全球的棘手問(wèn)題[1]。當(dāng)前西醫(yī)治療胃癌的方式主要是放療與化療，另外涉及有免疫、靶向治療等[2]。然而胃癌患者的死亡率5年高達(dá)75%以上，且這些治療大都存在較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3]。中醫(yī)藥治療作為中國(guó)傳統(tǒng)治療特色方法，隨著中醫(yī)學(xué)科的發(fā)展，中醫(yī)治療的運(yùn)用也變得越來(lái)越廣泛[4]。半枝蓮又名并頭草、韓信草等，《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）中記載其為唇形科植物的干燥全草，其性味辛，苦，寒，歸于肺，肝，腎經(jīng)。有清熱解毒，散瘀利尿之功效，可用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、水腫、黃疸、毒蛇咬傷[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，半枝蓮中所含黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)及多糖類(lèi)化合物等具有抗癌，抗病毒以及促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的作用[6]。中藥白花蛇舌草又名羊須草、蛇舌草、蛇總管等，為茜草科耳草屬植物，性味甘，淡，涼，并入胃，大、小腸經(jīng)，有清熱解毒，利尿消腫，止痛活血之功效，用于治療肺熱喘咳、腸癰、痢疾、濕熱黃疸、咽喉腫痛等疾病，亦擅長(zhǎng)治療多種癌腫?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草中所含黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)化合物等可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡[6-7]。半枝蓮與白花蛇舌草亦分別可見(jiàn)于《江蘇植藥志》《廣西中藥志》，兩者具有多種生物活性，聯(lián)合使用可清熱解毒、散瘀止血、利尿、消除腫脹與結(jié)節(jié)等，也常運(yùn)用于治療多種癌癥疾病與炎癥[7-8]。由目前的中醫(yī)學(xué)科研究來(lái)看，聯(lián)合用藥往往相較于單味用藥效果更佳[9-10]。

臨床療效與現(xiàn)代的藥理學(xué)研究都表明，半枝蓮-白花蛇舌草可以對(duì)癌癥抑制、炎癥消除及免疫調(diào)節(jié)等多方面都有比較好的功效[11-12]。本研究采用的是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接等技術(shù)手段，基于分子水平上更深層次地揭示半枝蓮-白花蛇舌草治療胃癌的機(jī)理。該研究挖掘剖析了半枝蓮-白花蛇舌草的有效組分、作用靶點(diǎn)以及主要信號(hào)通路，最終從微觀角度很好地闡述半枝蓮-白花蛇舌草抑制以及治療胃癌的機(jī)理。

1 技術(shù)與方法

1.1 構(gòu)建藥對(duì)化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù) 基于化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.organchem.csdb.cn.）和系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）兩個(gè)專(zhuān)業(yè)性平臺(tái)以及文獻(xiàn)中檢索挖掘獲得半枝蓮-白花蛇舌草中的活性化學(xué)成分并建立相應(yīng)化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)[13]。

1.2 藥效動(dòng)力學(xué)篩選 選擇藥效動(dòng)力學(xué)（ADME）模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定出藥物化學(xué)組分的口服生物利用度（OB）與類(lèi)藥性（DL）[14]，并把滿足 OB≥30%且 DL≥18%的有效成分作為候選化合物，另外通過(guò)文獻(xiàn)檢索篩選化學(xué)組分在滿足DL≥18%的情況下，OB＜30%但具有較好活性的藥物分子。兩種方式篩選出的化學(xué)組分合并作為半枝蓮-白花蛇舌草的有效化學(xué)組分。

1.3 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 該研究利用支持向量機(jī)（SVM）和隨機(jī)森林（RF）算法[15]于 DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）挖掘預(yù)測(cè)基因靶點(diǎn)，并設(shè)置參數(shù)滿足SVM≥0.7且RF≥0.8的基因靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein-Interaction，PPI）分析 將半枝蓮-白花蛇舌草有效組分對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)的64個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)[16]，挖掘獲得核心靶點(diǎn)，最后構(gòu)建半枝蓮-白花蛇舌草活性成分相應(yīng)核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對(duì)接 利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證中藥的活性組分與治療靶點(diǎn)的交互作用是否可靠，研究有效組分與目標(biāo)靶蛋白之間結(jié)合的方式與結(jié)合力。本研究采用AutoDock軟件[17]將半枝蓮-白花蛇舌草有效組分與目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。后將半枝蓮-白花蛇舌草有效組分對(duì)接到去掉原本配體的蛋白質(zhì)靶標(biāo)空腔里，對(duì)接完成后，選擇打分最高的對(duì)接復(fù)合體保留作為最優(yōu)的對(duì)接結(jié)合模式，然后利用自由能判定其有效組分與靶點(diǎn)的相關(guān)性。

1.6 富集分析 利用半枝蓮-白花蛇舌草有效組分的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8進(jìn)行GO富集分析[18]，篩選出胃癌與半枝蓮-白花蛇舌草有效成分相關(guān)程度較高的前5個(gè)分子的生物功能和相關(guān)通路。

1.7 分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 把通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘獲得的半枝蓮-白花蛇舌草的有效組分，相應(yīng)靶點(diǎn)及功能信息導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中[19]，在此基礎(chǔ)上建立起相互作用網(wǎng)絡(luò)、有效組分-目標(biāo)靶點(diǎn)-分子生物功能網(wǎng)絡(luò)，然后采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)相互作用關(guān)系[20]。

2 結(jié)果

2.1 有效組分篩選結(jié)果 該研究通過(guò)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘總共篩選出半枝蓮-白花蛇舌草的35個(gè)有效成分，其中白花蛇舌草篩選出有效成分8個(gè)，半枝蓮篩選出有效成分27個(gè)。本研究篩選有效組分是以滿足參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18作為篩選基礎(chǔ)條件，另外以文獻(xiàn)檢索的方式收集了OB不滿足以上條件但具有生物活性的藥物分子，如Sitogluside，Ursolic Acid[21]等也列入半枝蓮-白花蛇舌草有效組分?jǐn)?shù)據(jù)集。同時(shí)在半枝蓮的有效成分篩選結(jié)果中刪除了與白花蛇舌草有效成分重復(fù)的成分。篩選出的半枝蓮-白花蛇舌草有效組分都有CAS號(hào)與之對(duì)應(yīng)以保證成分真實(shí)性（表1）。

表1 半枝蓮-白花蛇舌草活性成分

2.2 分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 本研究將篩選后的35個(gè)半枝蓮-白花蛇舌草有效組分與64個(gè)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2[22]軟件中作圖以構(gòu)建有效組分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1）。其中雄激素受體（AR，carbonic anhydrase 2）、雌激素受體（ESR1，estrogen receptor）、碳酸酐酶 2（CA2，carbonic anhydrase 2）、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶 1（PTPN1，Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PIM1，proto-oncogene serine/threonine-protein kinase）、細(xì)胞分裂蛋白激酶 2（CDK2，cell division protein kinase 2）是與半枝蓮-白花蛇舌草有效組分相關(guān)程度最高的6個(gè)靶點(diǎn)（表2）。

圖1 有效組分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 半枝蓮-白花蛇舌草有效組分對(duì)應(yīng)的前15位靶點(diǎn)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 64個(gè)基因靶點(diǎn)被導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)后，得到了Color By Cluster，PPI Color By Cluster的PPI網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系圖，其中可見(jiàn)多個(gè)核心靶點(diǎn)互作關(guān)系（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 分子對(duì)接以及結(jié)合自由能分析 有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建完成后，從網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中選擇相關(guān)程度最高的6個(gè)基因靶點(diǎn)，另外再選擇半枝蓮和白花蛇舌草中相關(guān)程度最高有效成分各3個(gè)。分別把6個(gè)基因靶點(diǎn)與6個(gè)有效小分子格式轉(zhuǎn)化后在AutoDock軟件中進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接后各有效組分和基因靶點(diǎn)的結(jié)合模式表明，二者可緊密結(jié)合（圖3、圖4），對(duì)接后顯示分子與基因靶點(diǎn)間的結(jié)合能力與結(jié)合自由能（表3），結(jié)果顯示有效組分小分子與基因靶點(diǎn)間的結(jié)合能力比較強(qiáng)。表明半枝蓮-白花蛇舌草有效成分小分子可以與相應(yīng)基因靶點(diǎn)結(jié)合，也證實(shí)了所預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 活性成分-基因靶點(diǎn)分子對(duì)接的結(jié)合空腔

圖4 活性成分-基因靶點(diǎn)分子對(duì)接的結(jié)合模式

表3 前6名靶點(diǎn)與有效組分間的結(jié)合自由能

2.5 GO富集分析 在此分析過(guò)程中將以上篩選出的有效組分與基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID6.8平臺(tái)內(nèi)，且設(shè)置物種為人源，對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行處理，從而確定出相應(yīng)靶點(diǎn)的分子功能。而后進(jìn)一步處理作有效組分-靶點(diǎn)-GO分析的柱狀圖與氣泡圖（圖5）。對(duì)分子功能進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)相關(guān)度最高的功能依次為神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（Neurotransmitter receptor activity）、G 蛋白偶聯(lián)受體活性（G protein coupled receptor activity）、G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（G protein-coupled neurotransmitter receptor activity）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor ac－tivity）、G蛋白偶聯(lián)的血清素受體活性（G proteincoupled serotonin receptor activity）。研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞免疫、凋亡、炎性反應(yīng)等過(guò)程中，這些分子功能都與之密切相關(guān)，且影響了胃癌的病理過(guò)程。

圖5 有效組分-基因靶點(diǎn)-分子功能的GO富集分析

2.6 分子-靶點(diǎn)-功能網(wǎng)絡(luò)分析 篩選出半枝蓮-白花蛇舌草有效成分與對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)后，利用篩選出的基因靶點(diǎn)于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中整理出靶點(diǎn)調(diào)控的生物功能。從而將有效組分、基因靶點(diǎn)、靶點(diǎn)調(diào)控功能導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中作圖（圖6）并分析，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析并得出結(jié)果，64個(gè)靶基因所調(diào)控的生物功能主要分為4類(lèi)，包括細(xì)胞分化與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、抗炎和機(jī)體防御功能。

圖6 有效組分-基因靶點(diǎn)-調(diào)控功能網(wǎng)絡(luò)

2.7 靶點(diǎn)-通路富集分析 將系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘得到的半枝蓮-白花蛇舌草活性成分相應(yīng)基因靶點(diǎn)映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析從而確定出靶點(diǎn)相關(guān)通路。對(duì)信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序，從而得到相關(guān)性最高的通路，依次為鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway，degree=17）、cGMP-PKG信號(hào)通路 （cGMP-PKG signaling pathway，degree=10）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway，degree=10）、cAMP 信號(hào)通路（cAMP signaling pathway，degree=8）（圖 7）。從而探討半枝蓮-白花蛇舌草治療胃癌的作用機(jī)制。

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集分析柱狀圖與氣泡圖

3 討論

以現(xiàn)有的胃癌治療來(lái)看，胃癌手術(shù)引發(fā)的各種副作用，易復(fù)發(fā)甚至造成死亡依然是全球的棘手課題。半枝蓮為唇形科黃芩多年生草本植物，有清熱解毒、活血化瘀等功效。白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物，有清熱解毒、消腫利尿的功效。兩者均有清熱解毒之功效并均以全草入藥，對(duì)治療腫瘤、炎癥有較好的療效。兩藥配伍，相須為用，適于中醫(yī)“七情和合”的組方原則，起到協(xié)同增效，清熱解毒、化瘀抗癌的功效[23]。在臨床運(yùn)用中，半枝蓮，白花蛇舌草常以藥對(duì)形式出現(xiàn)于“腫瘤和方”“乙肝解毒湯”和“二半二白湯”等經(jīng)典方中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明兩藥配伍亦用于治療肝癌、胃癌、肺癌等腫瘤疾病[24]。半枝蓮-白花蛇舌草常用于臨床上治療腫瘤，起到清熱解毒以消痰火之壑遏與活血化瘀以消腫潰堅(jiān)的作用[25]。半枝蓮與白花蛇舌草經(jīng)過(guò)不同比例的配比常用于臨床上治療胃癌、肝癌、肺癌等并取得較好的效果。大量的臨床運(yùn)用與經(jīng)驗(yàn)表明半枝蓮-白花蛇舌草用于治療癌癥、炎癥等療效明確且優(yōu)于單味藥的臨床運(yùn)用效果[26]。臨床上，半枝蓮-白花蛇舌草治療癌癥的運(yùn)用雖然比較多，但通過(guò)國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)半枝蓮-白花蛇舌草抑制或治療胃癌的活性成分、相關(guān)的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)、相關(guān)通路與生物途徑的作用機(jī)制研究尚且比較少見(jiàn)[27]。

通過(guò)對(duì)半枝蓮-白花蛇舌草的數(shù)據(jù)挖掘以及網(wǎng)絡(luò)整合分析可知半枝蓮-白花蛇舌草中含2-羥基-3-甲基蒽醌、菜油甾醇與槲皮素等多種活性成分?，F(xiàn)有研究已經(jīng)表明黃酮類(lèi)[28]、甾醇類(lèi)[29]、蒽醌類(lèi)[30]、萜類(lèi)[31]可治療胃癌并具有較好療效。例如活性分子槲皮素歸屬于黃酮一類(lèi)，可抑制PI3K/Akt通路來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[32]。另外，甾醇類(lèi)化合物如β-谷甾醇等可擾亂細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抑制胃癌發(fā)展等[33]；蒽醌類(lèi)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并可調(diào)節(jié)下游蛋白家族的成員，最終也誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序[34-37]。因此2-羥基-3-甲基蒽醌運(yùn)用于多種腫瘤治療[38]。以上結(jié)果表明本研究篩選活性成分的準(zhǔn)確性，以及半枝蓮-白花蛇舌草具有抗癌，抗炎與調(diào)節(jié)免疫等功能。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn) PIM1、CDK2、MAPK14為主要的靶點(diǎn)，有可能是在胃癌治療網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。PIM1參與到多種腫瘤發(fā)展過(guò)程[39]，如PIM1相應(yīng)基因無(wú)表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞增殖且促進(jìn)其凋亡[40]。CDK2可以正向調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期，并于某些惡性腫瘤中大量表達(dá)[41]。因此，半枝蓮-白花蛇舌草可能通過(guò)抑制CDK2的過(guò)表達(dá)來(lái)降低胃癌的惡性率與增殖率。此外，高表達(dá)的MAPK14可抑制細(xì)胞凋亡[42]，半枝蓮-白花蛇舌草可能通過(guò)抑制MAPK14的表達(dá)來(lái)對(duì)抗胃癌發(fā)展進(jìn)程。

在系統(tǒng)藥理學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘與分析之后，篩選出與半枝蓮-白花蛇舌草有效成分對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)結(jié)合度最高的通路，分別為Calcium、cGMP-PKG與Estrogen信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)其中鈣離子通路可調(diào)節(jié)胃癌的病理進(jìn)程[43]；cGMP-PKG信號(hào)通路亦可以調(diào)節(jié)激活下游鈣離子通路[44]，即半枝蓮-白花蛇舌草有可能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)部鈣離子濃度從而達(dá)到抑制胃癌的目的；在雌激素信號(hào)通路中，高濃度的雌激素起到減緩、抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用，反之促進(jìn)其功能，表明半枝蓮-白花蛇舌草可能影響雌激素信號(hào)通路表達(dá)最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上，已有研究表明半枝蓮-白花蛇舌草可以有效抑制多種胃癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)[45-48]，且已有報(bào)道其用于臨床作為輔助治療胃癌，可見(jiàn)明顯效果且可靠安全[49-51]。由于其對(duì)胃癌治療的具體機(jī)制研究尚不多見(jiàn)，因此本研究闡釋了基于分子網(wǎng)絡(luò)研究半枝蓮-白花蛇舌草治療胃癌的多尺度作用機(jī)制，為中藥多途徑、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用機(jī)制方面的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)半枝蓮-白花蛇舌草運(yùn)用于胃癌治療提供一定的中醫(yī)理論依據(jù)。