殼聚糖基醫(yī)用補(bǔ)片的制備及其性能研究

劉大慶 高嵩巍 馬建偉 陳韶娟

1.青島大學(xué)紡織服裝學(xué)院，山東 青島266071；2.江蘇豐裕紡織科技有限公司，江蘇 南通226010

目前，隨著醫(yī)學(xué)和生物材料的不斷發(fā)展，醫(yī)用補(bǔ)片在修復(fù)人體部位缺陷，如疝氣修補(bǔ)、胸壁重建、心包修復(fù)、女性盆底重建、腎固定和硬腦膜修補(bǔ)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1]。用作醫(yī)用補(bǔ)片的材料有很多，如根據(jù)材料的性質(zhì)可分為合成材料[2]、生物材料和復(fù)合材料等[3-4]。合成補(bǔ)片具有良好的堅(jiān)韌度和生物惰性，在臨床腹壁缺損修補(bǔ)方面應(yīng)用較多，但使用過程中存在因補(bǔ)片皺縮而引發(fā)慢性疼痛及感染等問題[5]。生物補(bǔ)片具有優(yōu)良的抗感染性，且安全、無毒、可吸收，生物和組織相容性較好，應(yīng)用前景廣闊[6]。復(fù)合補(bǔ)片可以實(shí)現(xiàn)單一補(bǔ)片難以達(dá)到的理想狀態(tài)，并發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而保證在修復(fù)過程中組織生長(zhǎng)良好，并有效地減少粘連的發(fā)生。

殼聚糖(CS)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物[7]，屬天然的高分子生物材料，在動(dòng)植物體內(nèi)及真菌細(xì)胞體內(nèi)大量存在[8]。羧甲基化殼聚糖(CMC)是在殼聚糖分子鏈上引入羧基而形成的一種衍生物，具有良好的抑菌、抗氧化和止血等功能，其水溶性和重金屬螯合作用優(yōu)于殼聚糖[9-10]。因此，具有良好的生物相容性和可降解性的殼聚糖及殼聚糖基衍生物成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的生物材料[11]。

殼聚糖具有良好的成膜性，目前多采用傳統(tǒng)的延流法制備殼聚糖膜。本文將以完整的梭子蟹蟹殼為原料，在維持梭子蟹蟹殼原有形態(tài)的基礎(chǔ)上，依次對(duì)梭子蟹蟹殼進(jìn)行預(yù)處理，以及浸酸脫鈣質(zhì)、堿煮脫蛋白和濃堿脫乙酰化處理，制備性能優(yōu)良且完整的殼聚糖膜；然后，以殼聚糖膜為基材，進(jìn)一步采用氯乙酸法對(duì)殼聚糖膜進(jìn)行羧甲基化處理，制備羧甲基化殼聚糖膜；最后，探究殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的性能，以期為殼聚糖基醫(yī)用補(bǔ)片的應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

梭子蟹蟹殼(國(guó)產(chǎn))，鹽酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，NaOH(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，異丙醇(上海沃凱生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，氯乙酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，蒸餾水(青島盛天義生物有限公司)。

1.2 主要儀器

FA2204B型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，101-2型鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，SHZ-82型水浴恒溫振蕩器(金壇市實(shí)驗(yàn)儀器廠)，HTX-12P型紅外線小樣染色機(jī)(江蘇市華夏科技有限公司)，PHS-2C型雷磁pH酸度計(jì)(上海市理達(dá)儀器廠)，XG-CAM型接觸角測(cè)量?jī)x(上海軒鐵創(chuàng)析工業(yè)設(shè)備有限公司)。

2 殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的制備

2.1 殼聚糖膜的制備

對(duì)梭子蟹蟹殼依次進(jìn)行預(yù)處理、浸酸脫鈣質(zhì)、堿煮脫蛋白和濃堿脫乙?；幚怼?/p>

預(yù)處理，即將梭子蟹蟹殼放在蒸餾水中清洗干凈，去除表面雜質(zhì)；浸酸脫鈣質(zhì)，即將預(yù)處理的梭子蟹蟹殼在溫度為25 ℃、體積分?jǐn)?shù)為7%的鹽酸溶液中處理24 h；堿煮脫蛋白，即使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH溶液在60 ℃條件下對(duì)脫鈣質(zhì)后的梭子蟹蟹殼處理4 h；濃堿脫乙酰處理，即采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液分別在120、125和130 ℃的條件下對(duì)堿煮脫蛋白后的梭子蟹蟹殼處理1.0、1.5和1.5 h，后經(jīng)超聲清洗和鼓風(fēng)干燥箱干燥，得到殼聚糖膜備用。

2.2 羧甲基化殼聚糖膜的制備

殼聚糖膜的羧甲基化主要包含溶脹、堿化和羧甲基化這3個(gè)步驟。溶脹是在室溫條件下，將1.0 g制備的殼聚糖膜放入100 mL異丙醇和蒸餾水的混合溶液中反應(yīng)1 h，其中異丙醇和蒸餾水的體積比為8∶2；接著，將溶脹的殼聚糖膜與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaOH溶液在40 ℃的條件下反應(yīng)4 h，完成堿化過程；然后，向該反應(yīng)體系中加入15 mL的氯乙酸/異丙醇溶液(氯乙酸與異丙醇質(zhì)量比為1∶1)，在60 ℃的條件下充分反應(yīng)，完成殼聚糖的羧甲基化，再經(jīng)醇洗干燥，獲得羧甲基化殼聚糖膜備用。

3 羧甲基化取代度的測(cè)定

本試驗(yàn)先稱取0.1 g制備的羧甲基化殼聚糖膜，溶解于20 mL、0.1 mol/L的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液中；然后，配置一定量的0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，每次向HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液中滴入1 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，并用PHS-2C型雷磁型pH計(jì)(配有E-201-C型pH復(fù)合電極)測(cè)試pH值的變化，記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，獲取電位滴定曲線；最后，根據(jù)電位滴定曲線得到滴定終點(diǎn)，再根據(jù)式(1)和式(2)分別計(jì)算得到羧甲基化取代度kDS[14]。

(1)

(2)

式中：n——單位質(zhì)量羧甲基化殼聚糖膜中羧甲基物質(zhì)的量，mol/g；

c——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V1——滴定HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V2——滴定—CH2COOH時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

m——羧甲基化殼聚糖膜的凈質(zhì)量，g。

4 殼聚糖膜及羧甲基化殼聚糖膜基本性能的測(cè)試

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，理想的醫(yī)用補(bǔ)片應(yīng)理化性能穩(wěn)定，具有良好的生物相容性，使用后無炎癥和排斥反應(yīng)；同時(shí)應(yīng)具有良好的溶脹性、吸水性、潤(rùn)濕性及抗菌性等，以便實(shí)現(xiàn)傷口處組織液較快吸收，促進(jìn)組織愈合和增生。本文將就殼聚糖膜及羧甲基化殼聚糖膜的溶脹性、吸水性、潤(rùn)濕性及抗菌性展開測(cè)試。

4.1 溶脹性

將殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜干燥至恒定質(zhì)量，裁剪成1 cm×1 cm的試樣各3份。先分別稱量并記錄試樣的初始質(zhì)量m0(g)；再分別將試樣浸入pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，室溫靜置 20 h，將試樣取出，用濾紙吸去試樣表面水分后稱取溶脹后的試樣質(zhì)量m1(g)。根據(jù)式(3)計(jì)算兩種試樣各自的溶脹率(kSI)：

(3)

最終試樣的溶脹率取各自測(cè)試結(jié)果的平均值。

4.2 吸水性

室溫下，各準(zhǔn)備3份一定面積的殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣浸于蒸餾水中，6 h后取出，用濾紙吸去各自表面的水分，稱取各自的質(zhì)量并記錄為m′1(g)，然后將試樣放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥后稱取各自的質(zhì)量記為m′0(g)。根據(jù)式(4)計(jì)算兩種試樣各自的吸水率(Q)：

(4)

最終試樣的吸水率取各自測(cè)試結(jié)果的平均值。

4.3 潤(rùn)濕性

使用XG-CAM型接觸角測(cè)量?jī)x獲取殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態(tài)接觸角圖像與靜態(tài)接觸角數(shù)值，以分析殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的表面潤(rùn)濕性能。

具體操作：首先將殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜裁剪成平整的小片并固定在玻璃片上，調(diào)整好玻璃片在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上的位置，將0.2 μL的蒸餾水滴加在小片的表面，此時(shí)可以從計(jì)算機(jī)圖像中看到一個(gè)清晰的小液滴，3 s時(shí)凍結(jié)圖像將畫面固定，然后讀取圖像中的靜態(tài)接觸角數(shù)值。

4.4 抗菌性

采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、接種的方法進(jìn)行抗菌性測(cè)試。分別稱取0.3 g的殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣，在完成培養(yǎng)基配制、試樣滅菌處理、菌液配制及試樣接種工序后，在其他條件完全相同的情況下，分別將含有殼聚糖膜試樣與羧甲基化殼聚糖膜試樣的燒瓶及對(duì)照組空燒瓶放于水浴恒溫振蕩器中振蕩接觸18 h，最后測(cè)試燒瓶中大腸埃希菌的細(xì)菌濃度。根據(jù)式(5)計(jì)算試樣對(duì)大腸埃希菌的抑菌率R(%)：

(5)

式中：x——對(duì)照組振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)大腸埃希菌的濃度均值，CFU/mL；

y——試樣振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)大腸埃希菌的濃度均值，CFU/mL。

5 結(jié)果與分析

5.1 羧甲基化取代度

利用電位滴定法得到羧甲基化殼聚糖膜的電位滴定曲線如圖1所示。

圖1 羧甲基化殼聚糖膜的電位滴定曲線

由文獻(xiàn)[15]可知，堿性條件下，羧甲基會(huì)在—OH和—NH2上發(fā)生取代反應(yīng)，且在—OH上的取代多于在—NH2上的取代。kDS<1.00時(shí)，表明羧甲基的取代主要發(fā)生在—OH上，生成了O-羧甲基化殼聚糖；kDS≥1.00時(shí)，表明羧甲基的取代在—OH和—NH2上同時(shí)發(fā)生，生成了O，N-羧甲基化殼聚糖[16]。

在羧甲基化殼聚糖膜的制備過程中，NaOH和氯乙酸的用量均會(huì)對(duì)羧甲基化有較大的影響[17]。殼聚糖具有較高的結(jié)晶度，反應(yīng)前需提前進(jìn)行堿化，以便氯乙酸進(jìn)入并與之充分反應(yīng)。當(dāng)氯乙酸用量過低時(shí)，羧甲基化取代反應(yīng)不徹底；當(dāng)氯乙酸用量過高時(shí)，氯乙酸的利用率會(huì)降低。李東華[18]考查了氯乙酸用量、NaOH用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間這4個(gè)因素的影響，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)m(殼聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶4.5∶1.4時(shí)，可制得kDS=1.21的羧甲基化殼聚糖膜。

本試驗(yàn)設(shè)定m(殼聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶20.0∶15.0，足量的氯乙酸能夠滲入殼聚糖膜的結(jié)晶區(qū)中充分反應(yīng)，使堿化更充分，所制備的羧甲基化殼聚糖膜的取代度為1.86(>1.00)，生成的是O，N-羧甲基化殼聚糖。

5.2 溶脹性和吸水性

溶脹性和吸水性是影響醫(yī)用補(bǔ)片性能的重要因素。從本質(zhì)而言，補(bǔ)片的吸水性和溶脹性與材料本身的結(jié)晶度和分子鏈上的親水基團(tuán)有關(guān)。材料的結(jié)晶度越高，則其內(nèi)部分子排列越規(guī)整有序，水分子越難以進(jìn)入，故其吸水率和溶脹率越低。反之，材料的結(jié)晶度越低，則其吸水率和溶脹率越高[19]。

殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率和吸水率結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率

圖3 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的吸水率

由圖2和圖3可以看出：與殼聚糖膜試樣相比，羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率和吸水率顯著提高，這表明后者在醫(yī)學(xué)應(yīng)用時(shí)更有利于對(duì)傷口部位滲出液的吸收，為傷口的愈合提供一個(gè)干燥的環(huán)境，并有利于抑制傷口部位細(xì)菌的滋生。

5.3 潤(rùn)濕性

殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態(tài)接觸角均值如圖4所示。

圖4 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態(tài)接觸角均值

由圖4可以看出：羧甲基化殼聚糖膜試樣的親水性更顯著，表明其潤(rùn)濕性更好，這與其吸水率測(cè)試結(jié)果一致。

5.4 抗菌性

采用10倍稀釋法，分別將對(duì)照組燒瓶中的菌液、含有殼聚糖膜試樣和含有羧甲基化殼聚糖膜試樣的菌液稀釋3次后，各吸取1mL菌液置于培養(yǎng)皿上，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)皿上大腸埃希菌菌落的生長(zhǎng)情況(圖5)。

a) 對(duì)照組菌液

再采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算各平板中細(xì)菌的數(shù)量，通過式(5)計(jì)算殼聚糖膜試樣與羧甲基化殼聚糖膜試樣的抑菌率，結(jié)果如表1所示。

表1 殼聚糖膜與羧甲基化殼聚糖膜的抑菌率

由表1可知，殼聚糖膜試樣對(duì)大腸埃希菌的抑菌率高達(dá)99.0%，抑菌效果顯著。殼聚糖膜中含有大量的氨基，在酸性條件下部分氨基質(zhì)子化以—NH3+的形式存在，可與細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生作用，從而起到抑菌的作用。羧甲基化殼聚糖膜對(duì)大腸埃希菌的抑菌率為33.9%，有一定的抑菌效果，但與殼聚糖膜相比其抗菌性較低，原因可能與羧甲基化殼聚糖膜的取代度較高，導(dǎo)致能與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合的—NH3+減少有關(guān)。

6 結(jié)論

本文以梭子蟹蟹殼為原料，經(jīng)稀鹽酸和稀堿處理后，去除梭子蟹蟹殼中的鈣質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，得到甲殼素膜，再經(jīng)過濃堿脫乙?；笾频脷ぞ厶悄ぃ詈髿ぞ厶悄ぴ诘蜏貕A性條件下和氯乙酸發(fā)生取代反應(yīng)，制得了高取代度(kDS=1.86)的羧甲基化殼聚糖膜。

由溶脹性、吸水性、潤(rùn)濕性及抗菌性的測(cè)試結(jié)果可知，羧甲基化殼聚糖膜具有較好的溶脹性、吸水性和潤(rùn)濕性，對(duì)大腸埃希菌具有一定的抗菌性?？傮w而言，羧甲基化殼聚糖膜在醫(yī)用補(bǔ)片領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊的前景，關(guān)于其抑菌性能有待做進(jìn)一步的探索。