丁苯酞聯(lián)合肢體缺血后處理對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用#

陽昀 程超 張沖 唐園燕 廖小明 周茜

（桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541199）

2009年，Ren等人首次證實(shí)肢體缺血后處理（Limb ischemic postconditioning，LPostC）可減輕腦缺血再灌注損傷[1]。自此，隨著研究的深入這一結(jié)論被眾多國內(nèi)外學(xué)者證實(shí)[2]，且由于其安全、操作簡單易于推廣，因此具有廣闊的臨床前景。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)LPostC通過抵抗氧化應(yīng)激、減輕血腦屏障損傷和抑制凋亡來發(fā)揮保護(hù)作用[3-5]。在多種動物模型及臨床研究中，丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）均被證實(shí)具有改善腦缺血再灌注損傷效果[6-8]，現(xiàn)已作為我國急性缺血性腦卒中診治指南推薦用藥。但目前未見NBP聯(lián)合LPostC治療缺血性腦卒中的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬探討NBP聯(lián)合LPostC對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

丁苯酞膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司），DAB顯示試劑盒、Caspase-3兔多克隆抗體和Caspase-9兔多克隆抗體（碧云天生物技術(shù)公司）、SOD、MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），DD-2型雙極電凝器（北京東方神健醫(yī)療器械有限公司），752型紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠75只，體重250～280 g（由桂林醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供）。隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、肢體缺血后處理組（LPostC組）、丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）后處理組（NBP組）和同時(shí)予NBP+LPostC的聯(lián)合后處理組（NL組），每組15只。

1.1.3 大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備及治療

除假手術(shù)組外，所有大鼠均采用石蠟線栓法建立大腦中動脈缺血再灌注模型，具體如下：SD大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛300 mg·kg-1麻醉后，游離左側(cè)頸外動脈，用頭端蘸有石蠟的魚線（φ= 0.26 mm）從左側(cè)頸外動脈插入，深度約18～20 mm，栓塞左側(cè)大腦中動脈。缺血2 h后，將線栓拔出1 cm實(shí)現(xiàn)再灌注。

缺血2 h后，NBP組和NL組腹腔注射丁苯酞80 mg·kg-1，其余大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。LPostC組與NL組在再灌注同時(shí)，夾閉雙側(cè)股動脈5 min，再灌注5 min，反復(fù)循環(huán)3次后，再灌注24 h。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能評定

神經(jīng)功能缺損評分：參照Longa等評分標(biāo)準(zhǔn)，各組隨機(jī)選取10只大鼠，分別于再灌注24 h后進(jìn)行評分。0分：正常，無神經(jīng)學(xué)征象；1分：動物不能完全伸展右前肢；2分：動物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3分：動物行走向右側(cè)跌倒，或動物不能站立或動物打滾；4分：無自發(fā)活動，有意識障礙。神經(jīng)功能缺損評分在1～3分為模型成功，0分和4分為模型不成功。

1.2.2 比色法測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）含量

再灌注24 h后，每組隨機(jī)選5只大鼠斷頭取腦，取梗死側(cè)大腦半球制成10%腦組織勻漿，以3000 r·min-1離心10 min、取上清液，BCA法測定蛋白濃度，按試劑盒說明書進(jìn)行MDA和SOD測定。

1.2.3 免疫組化測定Caspase-3和Caspase-9表達(dá)

再灌注24 h后，各組隨機(jī)選取5只大鼠斷頭取腦，切取視交叉前后各2 mm厚的腦組織塊，經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后切成厚5 μm薄片，采用免疫組化法檢測Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為陽性細(xì)胞。在10×40倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)，算出平均值，即為每張切片陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評定

Sham組大鼠術(shù)后24 h精神可，一般行為狀態(tài)正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀及體征, 評分0分。與Sham組相比，I/R組、NBP組、LPostC組和NL組均出現(xiàn)不同程度的偏癱，評分明顯升高（P＜0.05）。相較I/R組，NBP組、LPostC組及NL組神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）；且NL組評分比NBP組和LPostC組更低。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±SD, n=10）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±SD, n=10）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與NBP組比較，◆P＜0.05；與LPostC組比較，?P＜0.05。

組別 神經(jīng)功能評分 Sham組 0 I/R組 2.6±0.16* NBP組 1.7±0.15# LPostC組 1.8±0.0.2# NL組 1.2±0.13?Δ

2.2 腦組織勻漿中MDA含量和SOD活性的變化

與Sham組相比，I/R組腦組織中MDA含量明顯增加，SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與I/R組比較，NBP組、LPostC組和NL組腦組織中MDA含量明顯減少，SOD活性顯著升高（P＜0.05）；與NBP組和LPostC組相比，NL組腦組織中MDA含量進(jìn)一步減少，SOD活性進(jìn)一步升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腦組織中MDA含量、SOD活性的比較（±SD, n=5）

表2 各組大鼠腦組織中MDA含量、SOD活性的比較（±SD, n=5）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與NBP組比較，?P＜0.05；與LPostC組比較，ΔP＜0.05。

組別 MDA（nmol·mgprot-1） SOD（U·mgprot-1） Sham組 3.23±0.11 160.6±4.06 I/R組 6.21±0.22* 64.0±3.26* NBP組 3.96±0.12# 107.4±4.31# LPostC組 3.89±0.11# 107.8±4.77# NL組 4.63±0.19?Δ 121.8±2.89?Δ

2.3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)

Sham組大鼠腦組織僅有少量陽性細(xì)胞表達(dá)；而與Sham組相比，I/R組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，NBP組、LPostC組和NL組陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；與NBP組和LPostC組相比，NL組抑制Caspase-3和Caspase-9表達(dá)程度更強(qiáng)（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細(xì)胞情況（±SD，n=5）

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細(xì)胞情況（±SD，n=5）

組別 Caspase-3陽性細(xì)胞 （個(gè)·HP-1） Caspase-9陽性細(xì)胞 （個(gè)·HP-1） sham組 6.2±1.16 5.8±1.15 I/R組 47.4±2.46* 49.2±2.22* NBP組 20.0±1.58# 23.8±1.53# LPostC組 23.2±1.66# 24.4±1.65# NL組 14.6±1.44?Δ 15.8±1.36?Δ

3 討論

我國約70%卒中患者為缺血性腦卒中[9]，恢復(fù)缺血區(qū)域血流灌注是治療策略的重點(diǎn)；然而目前對于缺血再灌注損傷的發(fā)生仍是治療的難點(diǎn)，普遍認(rèn)為其相關(guān)病理生理機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激（氧自由基大量產(chǎn)生）、炎性因子升高、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞等[10-12]。本項(xiàng)研究表明，腦缺血再灌注損傷后，以MDA為代表的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物大量生成，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)凋亡因子Caspase-3和Caspase-9活性顯著增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生；這與前人的研究結(jié)果一致。

多年來，眾多學(xué)者致力于探索減輕腦缺血再灌注損傷的藥物與措施。丁苯酞是我國自主研發(fā)的藥物，研究表明其神經(jīng)保護(hù)作用與改善大腦缺血區(qū)血流量及微循環(huán)、抗血小板聚集與血栓形成、抑制細(xì)胞凋亡、抗自由基作用等有關(guān)[13-15]。LPostC也被證實(shí)對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)機(jī)制，其主要機(jī)制包括調(diào)節(jié)突觸信號、減輕氧化應(yīng)激和炎癥、維持線粒體完整性、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、調(diào)節(jié)自噬、激活PI3K/Akt通路、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)血管單位等[16]。

目前未見關(guān)于LPostC聯(lián)合丁苯酞治療缺血性腦卒中的相關(guān)研究，聯(lián)合應(yīng)用是否可增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用也未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，丁苯酞和LPostC均可減少M(fèi)DA含量及增加SOD活性，提示機(jī)體減少產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物且清除氧自由基能力增強(qiáng)，表明氧化應(yīng)激被抑制；這與前人的研究結(jié)果一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)LPostC聯(lián)合丁苯酞可提高減少M(fèi)DA產(chǎn)生及SOD活性，強(qiáng)化氧自由基的清除能力，更好的抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族（Caspases）是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶。腦缺血后線粒體受損導(dǎo)致線粒體膜持續(xù)開放，細(xì)胞色素C、dATP、凋亡蛋白激活因子-1等形成復(fù)合體，激活Caspase-9及下游的Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡發(fā)生[17]。本研究顯示，丁苯酞和LPostC均下調(diào)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，并且聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步抑制其表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，從而挽救更多的缺血半暗帶組織，減輕缺血再灌注損傷。

綜上所述，肢體缺血后處理或丁苯酞后處理均對腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，且聯(lián)合應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)效果更好，其機(jī)制可能其與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

PROGRESS

Preliminary Findings of mRNA Covid-19 Vaccine Safety in Pregnant Persons

Tom T Shimabukuro, et al.

Preliminary findings did not show obvious safety signals among pregnant persons who received mRNA Covid-19 vaccines. However, more longitudinal follow-up, including follow-up of large numbers of women vaccinated earlier in pregnancy, is necessary to inform maternal, pregnancy, and infant outcomes.

N Engl J Med. 2021 Apr 21;NEJMoa2104983. doi: 10.1056/NEJMoa2104983.