三七聯(lián)合丙泊酚治療外傷性腦損傷療效及機(jī)制的研究

王利梅，楊騏睿，李成，王金偉，吳春妍，王瓊仙

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，云南 昆明；2 云南省骨科醫(yī)院，云南 昆明；3 昆明醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院，云南 昆明；4 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；云南 昆明)

0 引言

腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分, 是人類意識、思維、心理活動的中心, 一旦由于缺氧、出血、梗死、變性疾病等原因造成大量神經(jīng)元缺失時,導(dǎo)致外傷性腦損傷（traumatic brain injuries，TBI）因不能產(chǎn)生新的神經(jīng)元而致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能難以恢復(fù)。找到合理的腦損傷治療方案尤為重要。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( brain derived neurotrophic factor ,BDNF) 是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需的。

丙泊酚是目前臨床上普遍用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持、ICU 危重病人鎮(zhèn)靜的一種新型快速、短效靜脈麻醉藥。因此丙泊酚對腦組織的作用已得到越來越多的關(guān)注，許多學(xué)者提出丙泊酚對損傷腦組織存在保護(hù)作用[1-3]。

三七為五加科多年生草本植物，臨床主要用于治療心腦血管疾病及跌打損傷等。近年來三七總皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用尤引人關(guān)注，許多學(xué)者已證明其對腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用[4]。

基于此，本項目是在復(fù)習(xí)大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上擬調(diào)查三七聯(lián)合丙泊酚對腦的治療效果，是否是通過上調(diào)BDNF 及其受體TrkB 和下游信號分子來實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 動物的分組

140只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重200±20g，隨機(jī)分為四大組。正常組(假手術(shù)組，A 組），TBI 組(腦損傷組，B 組），TBI+丙泊酚組(丙泊酚治療腦損傷組，C 組），TBI+丙泊酚+三七組(三七聯(lián)合丙泊酚治療腦損傷組，D 組）。實驗動物購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，實驗動物質(zhì)量合格證號：SYSK( 滇)2005-0004，許可證號SCXK( 滇)2011-0004。

1.2 動物模型建立與藥物治療

采用改良的Feeney 氏 法自由落體撞擊制作腦外傷模型。用3.6%水合氯醛(1ml/100g)進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉完全后,將大鼠俯臥位固定，常規(guī)消毒鋪巾,在頭距前囟5mm 處冠狀切開皮膚成“V”或“U”型切口,將頭皮向尾側(cè)翻開。分離骨膜,暴露右側(cè)頂骨,于矢狀縫旁開2.5mm,冠狀縫后1.5mm 鉆一骨孔,咬除顱骨直至骨窗擴(kuò)大為直徑5.0mm×5.0mm,顯露硬腦膜，注意保護(hù)矢狀竇和硬腦膜。將潔凈的墊片輕輕地置于骨窗中央，以50g 重的鐵質(zhì)圓柱體自30cm 高處沿鐵桿自由落體撞擊墊片,造成右側(cè)大腦運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)挫裂傷。假手術(shù)僅咬除顱骨，不進(jìn)行砸傷，飼養(yǎng)護(hù)理同手術(shù)組。術(shù)后前3型每日給腦外傷大鼠腹腔注射頭孢8萬單位預(yù)防感染，術(shù)后2 周內(nèi)每日早晨8 點(diǎn)給予藥物治療，劑量及給藥方式如下： 丙泊酚20mg/kg，腹腔注射。三七 10mg/d[5]。

1.3 行為學(xué)評價

1.3.1 大鼠的神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity score,NSS）

分別于損傷后1d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d 和13d 進(jìn)行神經(jīng)功能雙盲法評分，三個經(jīng)過培訓(xùn)熟練掌握評分標(biāo)準(zhǔn)的人進(jìn)行評分，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)評分，每天評分時間固定在早上8 點(diǎn)。

1.3.2 電生理CSEP 皮層體感誘發(fā)電位檢測

將大鼠頭部固定于腦立體定位儀平臺,剪去顱頂毛,在前囪部位沿中線切開皮膚1.5cm,鈍性分離,充分暴露顱骨,清楚地暴露顱骨骨縫,在冠狀縫后緣1-2mm、矢狀縫旁開2-3mm,手持電鉆,用2.5mm 球形牙科鉆緩緩鉆磨顱骨(要求鉆頭軸心傾斜與顱骨面成30°夾角),要求恰好鉆到出現(xiàn)白色的、略帶透明的骨皮質(zhì),然后用眼科鑷輕輕挑起殘余的骨皮質(zhì),并小心剝離,即可暴露出完好的硬腦膜。然后將銀球引導(dǎo)電極用萬向夾固定于鉆孔處,相當(dāng)于皮層感覺運(yùn)動區(qū)(額頂區(qū))，隨后將2個注射針頭分別插入大鼠對側(cè)前爪腕部的兩側(cè)皮膚,刺激輸出的2個電極(注意2個電極不能相觸)分別連接2個注射針頭,開始刺激并觀察誘發(fā)電位的變化。

1.4 樣本獲取

NSS 評分及電生理檢測結(jié)束后，開始灌注固定取材，用于形態(tài)學(xué)研究；每組15只。材料放入4%多甲固定過夜，其他動物模型，分別治療后3d、14d，進(jìn)行新鮮樣本取材；首先每個時間點(diǎn)10只/組，獲得腦組織，入-80℃冰箱備用。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

1d ： Sham 組，NSS 評分為0分，表明沒有受到損傷。TBI 組Sham 組比較，P=0.000 ＜0.01，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；丙泊酚治療組與TBI 組比較，P= 0.000 ＜0.01，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；三七治療組與TBI 組比較，P＞0.05 無統(tǒng)計學(xué)差異；說明三七治療需要一個累積效應(yīng)，只有在一定的時間，達(dá)到一定的血藥濃度，才能發(fā)揮其作用。

3d 直到13d：Sham 組，NSS 評分為0分，表明沒有受到損傷。TBI 組與Sham 組比較，損傷依次分別逐漸加重，P=0.000 ＜0.01，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；丙泊酚+TBI 治療組與TBI 組比較，損傷逐漸加重，P=0.000 ＜0.01，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；三七+丙泊酚+TBI 治療組與丙泊酚+TBI組比較，用了三七以后隨著三七累積數(shù)量的增加，損傷依次分別逐漸減輕，P=0.000 ＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異；說明三七治療TBI 有顯著的療效。

見圖1。

圖1 各組間每日所得神經(jīng)損傷程度評分

通過分析得出，三七治療需要一個累積效應(yīng)，只有在一定的時間，達(dá)到一定的血藥濃度，才能發(fā)揮其作用。其治療TBI 有顯著的療效。

3 討論

本實驗通過建立TBI 大鼠模型，用三七聯(lián)合丙泊酚治療后與治療前比較，通過行為學(xué)評價（NSS 評分和電生理CSEP 皮層體感誘發(fā)電位檢測）結(jié)果顯示：三七+丙泊酚+TBI 治療后與治療前比較，NSS 評分我們發(fā)現(xiàn)單純丙泊酚組，三七聯(lián)合丙泊酚組對TBI 損傷都有治療作用，但通過比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組展現(xiàn)出更好的治療效果；而CSEP電生理檢測結(jié)果我們可以看出，TBI 損傷后的確對大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)功能造成了抑制性的作用，經(jīng)過治療后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組能夠更好地讓神經(jīng)傳導(dǎo)功能有一個好的恢復(fù)作用，可能是由于在治療過程中三七通過其活血化瘀，抵抗神經(jīng)氧化損傷的功能使神經(jīng)元的損傷在一定程度上得到修復(fù)[6-8]。通過觀察聯(lián)合用藥（丙泊酚+三七）來治療TBI 大鼠后的NSS 評分及CSEP 電生理檢測發(fā)現(xiàn)其與丙泊酚TBI 組在神經(jīng)損害恢復(fù)結(jié)果中并無統(tǒng)計學(xué)差異的存在（P＞0.05），但在將腦皮質(zhì)樣本經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)在使用聯(lián)合用藥后丙泊酚TBI 組應(yīng)有的炎癥細(xì)胞因子合成釋放被抑制的現(xiàn)象消失了，出現(xiàn)了降低后的一個BDNF 升高表達(dá)的上調(diào)，從而影響其受體 TrkB 升高而上調(diào)[9-11]。

只有兩者同時上調(diào)，才能完美結(jié)合，發(fā)揮BDNF 的生物學(xué)神經(jīng)營養(yǎng)的作用[12]。