益氣活血中藥對(duì)良性前列腺增生模型大鼠的治療作用及對(duì)前列腺B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白表達(dá)的影響※

肖友平 阮 明 黃從軍 范 凱

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽(yáng) 550000)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)疾病之一，臨床表現(xiàn)為膀胱刺激癥狀及梗阻癥狀，可對(duì)患者的身體健康及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)作為細(xì)胞凋亡抑制基因蛋白，在BPH的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用，通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)可以有效抑制前列腺增生[2-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，BPH多好發(fā)于老年人，腎氣虧虛是其發(fā)病之本，氣虛血瘀是其發(fā)病的主要原因，益氣活血是臨床治療BPH的主要方法[4-6]。為進(jìn)一步探討中醫(yī)藥治療BPH的作用機(jī)制，我們以益氣活血法為治則組方，觀察其對(duì)BPH模型大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，以期為臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠90只，10～12周齡，體質(zhì)量180～220 g，在室溫(20±3)℃、相對(duì)濕度40%～60%的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下飼養(yǎng)，每日照明持續(xù)12 h，自由飲水和進(jìn)食，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 益氣活血中藥(藥物組成：黃芪30 g，桃仁20 g，桂枝15 g，茯苓15 g，牡丹皮15 g，川牛膝15 g，荔枝核10 g，肉桂6 g。每劑生藥總量為126 g，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院智能顆粒藥房負(fù)責(zé)加工濃縮制成每劑10.29 g的中藥顆粒制劑)；丙酸睪酮注射液[寧波市第二激素廠，獸藥字(2016)110251054]；非那雄胺片(杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150142)。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器 Bcl-2免疫組化檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；電子天平(上?；ǔ彪娖饔邢薰荆吞?hào)UTP313)；生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號(hào)BX-53)；組織包埋盒(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Image J圖像分析軟件系統(tǒng)(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備 采用雄性激素誘導(dǎo)法進(jìn)行建立BPH模型大鼠。將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(19只)和模型手術(shù)組(71只)。所有大鼠均予10%水合氯醛(3.5 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，模型手術(shù)組大鼠行雙側(cè)睪丸切除術(shù)，假手術(shù)組大鼠切開(kāi)外陰皮膚游離但并不切除睪丸，隨后縫合皮膚。所有大鼠均自然飼養(yǎng)恢復(fù)1周后，模型手術(shù)組大鼠予丙酸睪酮注射液5 mg/kg(以橄欖油10 mL/kg為溶媒)皮下注射，每日1次，連續(xù)給藥4周，假手術(shù)組大鼠僅予橄欖油10 mL/kg皮下注射，每日1次，連續(xù)4周。4周后假手術(shù)組及模型手術(shù)組分別隨機(jī)挑選6只大鼠，處死并取前列腺，通過(guò)大鼠前列腺濕質(zhì)量指數(shù)及組織病理變化判斷證實(shí)造模成功[7]。

1.4.2 分組及給藥方法 將模型手術(shù)組剩余65只大鼠隨機(jī)分為模型組、非那雄胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組及中藥高劑量組，每組13只，以及假手術(shù)組剩余大鼠13只，共6組。假手術(shù)組及模型組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液5 mL/d灌胃，非那雄胺組大鼠非那雄胺片藥液予0.8 mg(kg·d)(以0.9%氯化鈉注射液5 mL為溶媒)灌胃，中藥低、中、高劑量組每日分別予益氣活血中藥顆粒藥液0.85、1.70、2.55 g/(kg·d)(以0.9%氯化鈉注射液5 mL為溶媒)灌胃，均每日1次，連續(xù)灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 前列腺濕質(zhì)量指數(shù) 各組大鼠末次灌胃24 h后稱體質(zhì)量，然后采用脫頸法處死，立即打開(kāi)腹腔，分離前列腺周圍組織，取出前列腺，去除附帶組織，用濾紙吸干表面液體，并用天平稱取前列腺濕質(zhì)量，計(jì)算前列腺濕質(zhì)量指數(shù)。前列腺濕質(zhì)量指數(shù)=前列腺濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

1.5.2 前列腺組織病理觀察 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察前列腺組織病理情況。取部分前列腺組織切片，先放入蒸餾水，然后放入蘇木素水溶液中染色數(shù)分鐘，放入酸水及氨水中分色各數(shù)秒鐘，水洗1 h后加入蒸餾水中數(shù)秒鐘，在70%、90%乙醇中脫水各10 min，酒精伊紅染色2～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，最后將材料周圍多余的液體迅速清除，滴入適量中性樹(shù)膠，蓋上清潔蓋玻片，在生物顯微鏡下(×200)觀察前列腺組織病理變化情況。

1.5.3 Bcl-2蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)情況。將剩余前列腺組織在4%多聚甲醛溶液中固定20 h，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，組織切片。然后按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，添加一抗體后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗標(biāo)本，然后滴入二抗體，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，在生物顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色，最后采用Image J圖像分析軟件檢測(cè)各組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠灌胃后前列腺濕質(zhì)量指數(shù)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠灌胃后前列腺濕質(zhì)量指數(shù)比較

由表1可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組及中藥低、中劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量指數(shù)均明顯增加，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，非那雄胺組及中藥高劑量組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，非那雄胺組及中藥中、高劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量指數(shù)均明顯降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與非那雄胺組比較，中藥低、中劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量指數(shù)均明顯增加，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥高劑量組與非那雄胺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中藥各劑量組組間比較，中藥高劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量指數(shù)明顯低于中藥低、中劑量組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中藥低、中劑量組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠灌胃后前列腺組織病理變化情況 假手術(shù)組：腺體細(xì)胞呈單層矮柱狀排列，大小均勻，排列整齊有序，腺腔無(wú)擴(kuò)張，核仁染色明顯。模型組：腺體細(xì)胞排列非常密集，腺腔擴(kuò)大，腺上皮細(xì)胞呈乳頭狀或鋸齒狀向腺腔內(nèi)突起，間質(zhì)和小血管水腫，分泌物明顯增多。非那雄胺組：腺體細(xì)胞增生不明顯，腺腔基本光滑，間質(zhì)和小血管擴(kuò)張較少見(jiàn)。中藥低劑量組：腺體細(xì)胞排列致密，腺腔變大，分泌物增多，單層柱狀上皮細(xì)胞和高柱狀上皮細(xì)胞均可見(jiàn)。中藥中劑量組：腺體細(xì)胞輕度增生，腺體排列較整齊，小部分腺體細(xì)胞腺腔變大，少量分泌物，但腺腔基本光滑。中藥高劑量組：腺體細(xì)胞增生不明顯，排列較整齊，腺腔基本光滑，間質(zhì)和血管擴(kuò)張充血水腫較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠灌胃后前列腺組織病理變化

2.3 各組大鼠灌胃后前列腺組織中Bcl-2蛋白光密度值比較 見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組大鼠灌胃后Bcl-2蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠灌胃后列腺組織中Bcl-2蛋白光密度值比較

由表2可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組及中藥低劑量組Bcl-2蛋白光密度值均明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，非那雄胺組及中藥中、高劑量組與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，非那雄胺組及中藥低、中、高劑量組Bcl-2蛋白光密度值均明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與非那雄胺組比較，中藥低劑量組Bcl-2蛋白光密度值升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥中、高劑量組與非那雄胺組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中藥各劑量組組間比較，中藥中、高劑量組Bcl-2蛋白光密度值明顯低于中藥低劑量組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中藥中、高劑量組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

BPH是前列腺的一種良性病變，雖然不會(huì)對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅，但由于前列腺的體積增大、質(zhì)量增加而導(dǎo)致的尿頻、尿急、排尿困難等癥狀，都會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量及心理健康造成嚴(yán)重影響，部分患者甚至需要進(jìn)行導(dǎo)尿治療[8-9]。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，BPH的患病率也在逐年增加，不僅給患者及家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也占據(jù)了社會(huì)更多寶貴的醫(yī)療資源[10]。目前，BPH的病因尚未十分清楚，大量的研究顯示BPH的形成可能與雌激素與雄激素水平比例失衡有關(guān)[11]，此外細(xì)胞凋亡與抗凋亡基因的異常表達(dá)也在BPH的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為腺體細(xì)胞增生、腺腔增大、分泌物增多等[12]。近年來(lái)，細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因蛋白在BPH發(fā)病機(jī)制中的作用成為臨床上研究的熱點(diǎn)。Bcl-2蛋白是目前公認(rèn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，在BPH患者中主要由前列腺間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，以自分泌的形式調(diào)節(jié)前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡，通過(guò)增加雙氫睪酮的作用或調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用，其在增生的前列腺組織中表達(dá)明顯高于正常的前列腺組織，通過(guò)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)可明顯控制前列腺組織的增生[13-15]。

中醫(yī)學(xué)中并無(wú)BPH的病名，但根據(jù)其排尿困難的主要癥狀表現(xiàn)，可歸屬于癃閉的范疇，并認(rèn)為小便不利，點(diǎn)滴短少，病勢(shì)較緩為癃，小便不通，欲解不解，病勢(shì)較急為閉，氣虛血瘀是主要病機(jī)。《素問(wèn)·上古天真論》有言：“丈夫八歲，腎氣實(shí)，發(fā)長(zhǎng)齒更……七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。八八，則齒發(fā)去?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為先天之本，隨著年齡的增長(zhǎng)，腎氣漸虧，又腎主水液、主氣化，與膀胱相表里?！鞍螂渍撸荻贾?，津液藏焉，氣化則能出矣”(《素問(wèn)·靈蘭秘典論》)，膀胱儲(chǔ)尿和排尿的功能依賴腎的氣化。腎氣虧虛，則膀胱氣化不利，開(kāi)闔失度，而出現(xiàn)小便不利、排尿困難等；氣虛不足,推動(dòng)無(wú)力,則血行不暢，瘀滯血脈，停而為瘀。清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》有言:“元?dú)饧忍?必不能達(dá)于血管,血管無(wú)氣,必停留而瘀?！鼻濉ぶ軐W(xué)海《讀醫(yī)隨筆》有言：“氣虛不足以推血,則血必有瘀?！惫手委煈?yīng)以益氣活血為主。桂枝茯苓丸出自漢·張仲景《金匱要略》，具有活血化瘀、消癥散結(jié)的功效，是治療婦女行經(jīng)腹痛、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不盡等婦科疾病的經(jīng)典名方，現(xiàn)代學(xué)者依據(jù)異病同治的原則，對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行了拓展研究，現(xiàn)在其臨床應(yīng)用已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出婦科疾病的范疇，近年來(lái)大量的研究證實(shí)桂枝茯苓丸在男科疾病的治療中也有很好療效[16-18]。我們所用益氣活血中藥就是由桂枝茯苓丸化裁而來(lái)，方中黃芪健脾補(bǔ)虛，益氣固表；桃仁活血化瘀，破血行瘀；桂枝溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣；茯苓健脾寧心，利水滲濕；牡丹皮清熱涼血，活血化瘀；川牛膝補(bǔ)益肝腎，利尿通淋；荔枝核溫中行氣，散結(jié)止痛；肉桂補(bǔ)腎助陽(yáng)，活血通絡(luò)。諸藥合用，具有補(bǔ)脾益腎、益氣活血、利尿散結(jié)的功效。袁軼峰等[19]研究也證實(shí)，益氣活血消癥法能明顯降低BPH模型大鼠前列腺組織中Bcl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，促進(jìn)前列腺組織細(xì)胞的凋亡，從而改善BPH的臨床癥狀。

非那雄胺是特異性Ⅱ型5α-還原酶抑制劑，能夠抑制外周睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮，降低前列腺內(nèi)的二氫睪丸酮，從而抑制前列腺增生，改善BPH臨床癥狀[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠灌胃后前列腺濕質(zhì)量指數(shù)及Bcl-2蛋白光密度值較假手術(shù)組均明顯升高(P<0.05)，且前列腺組織病理表現(xiàn)出現(xiàn)腺體細(xì)胞增生、腺腔擴(kuò)大、腺上皮細(xì)胞呈乳頭狀或鋸齒狀向腺腔內(nèi)突起等，說(shuō)明造模成功。各治療組在給予相應(yīng)藥物灌胃治療后前列腺組織病理表現(xiàn)均有不同程度的改善，其中非那雄胺組及中藥中、高劑量組灌胃后前列腺濕質(zhì)量指數(shù)及Bcl-2蛋白光密度值較模型組均明顯降低(P<0.05)，而中藥低劑量組灌胃后僅Bcl-2蛋白光密度值低于模型組(P<0.05)，非那雄胺組及中藥高劑量組灌胃后前列腺濕質(zhì)量指數(shù)及Bcl-2蛋白光密度值與假手術(shù)組相當(dāng)(P>0.05)，說(shuō)明益氣活血中藥對(duì)BPH具有確切的治療作用，且不同劑量的益氣活血中藥對(duì)前列腺Bcl-2蛋白表達(dá)均有一定抑制作用，中藥高劑量組的治療效果與非那雄胺相當(dāng)，并可使前列腺濕質(zhì)量指數(shù)及Bcl-2蛋白光密度值達(dá)到正常水平。綜上所述，益氣活血中藥治療BPH療效確切，可明顯抑制BPH模型大鼠前列腺組織增生，改善前列腺組織病理表現(xiàn)，降低前列腺濕質(zhì)量指數(shù)，且治療效果具有一定的量效關(guān)系，高劑量的治療效果更好，其作用機(jī)制可能與抑制前列腺組織中Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。