人外周血淋巴細(xì)胞微核分析用于估算離體模擬局部照射劑量的研究

陸 雪，田雪蕾，趙 驊，蔡恬靜，田 梅，劉青杰

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

目前，對(duì)于電離輻射事故(以下簡稱事故)的生物劑量估算都是利用離體建立的劑量效應(yīng)曲線計(jì)算受照人員的全身等效劑量。若受照人員受到的是全身均勻照射，則用現(xiàn)有的辦法估算其生物劑量是較準(zhǔn)確的。然而大多數(shù)事故造成的是局部照射或不均勻照射。依然采用劑量效應(yīng)曲線估算全身等效劑量的辦法可能會(huì)嚴(yán)重低估受照人員的局部劑量，這可能對(duì)救治措施的選用產(chǎn)生很大影響。因此建立局部照射生物劑量估算的方法是十分重要且必要的。

一直以來，電離輻射引起的染色體畸變作為“金標(biāo)準(zhǔn)”應(yīng)用于事故照射的生物劑量估算。然而該指標(biāo)對(duì)分析人員技術(shù)水平要求高，耗時(shí)耗力，且當(dāng)受到較高劑量照射時(shí)會(huì)大大增加獲得中期分裂相細(xì)胞的難度。微核(micronuclei，MN)也廣泛應(yīng)用于事故生物劑量估算。該指標(biāo)相對(duì)于染色體畸變，其計(jì)數(shù)率較高，形態(tài)容易分辨，對(duì)分析人員技術(shù)水平要求低，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。因此，有必要探索MN應(yīng)用于局部照射生物劑量估算的可行性。Dolphin"s模型亦稱不純泊松分布模型，是國際原子能機(jī)構(gòu)(International Atomic Energy Agency，IAEA)推薦的用于估算局部照射劑量的模型之一。該模型可以較好的通過染色體畸變估算離體模擬局部照射劑量。

故此，本研究選用Dolphin"s模型，分析離體模擬局部照射下的人外周血雙核淋巴細(xì)胞微核，探索其應(yīng)用于局部照射劑量估算的可行性，為進(jìn)一步研究其應(yīng)用于在體局部照射奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用方便抽樣方法，選取2例健康成年人為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：無吸煙飲酒，1年內(nèi)未接觸放射線，無有毒有害化學(xué)物質(zhì)接觸史，無家族遺傳病史，無急慢性病史，無特殊用藥史。該兩名供血者均為女性，樣本A年齡為40周歲，樣本B年齡為32周歲。無菌條件下每人采集肘靜脈血4 mL，置于肝素鋰抗凝管中。本研究經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(編號(hào)LLSC2020-008)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 照射條件

Coγ射線照射由北京市輻照中心提供。照射劑量為1和5 Gy，劑量率為1 Gy/min。照射野面積為25 cm×25 cm，樣本距源距離為78 cm。

1.3 離體模擬局部照射實(shí)驗(yàn)

本研究將樣本A和樣本B的血樣各分為兩部分，一部分不照射，另一部分再分為兩組分別在1和5 Gyγ射線下進(jìn)行離體均勻照射，劑量率為1 Gy/min。照射后將樣本A及樣本B的已照射及未照射的血樣一共6個(gè)樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，然后將各劑量點(diǎn)照射血樣與同一樣本的未照射血樣按1∶3和3∶1比例混合均勻，最終將一共8個(gè)血樣進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。通過細(xì)胞分裂阻滯(cytokinesis-block micronucleus，CBMN)法制備MN標(biāo)本。

1.4 外周血淋巴細(xì)胞MN分析

按照《WS/T 187—1999淋巴細(xì)胞微核估算受照劑量方法》推薦的方法分析計(jì)數(shù)MN。每張MN標(biāo)本分析1 770～3 307個(gè)雙核淋巴細(xì)胞，記錄MN數(shù)量。結(jié)果以每1 000個(gè)細(xì)胞含有的微核數(shù)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及劑量估算

2 結(jié)果

2.1 離體模擬局部照射情況下人外周血淋巴細(xì)胞MN的分布情況

電離輻射誘導(dǎo)的MN的分布若符合泊松分布，則表明細(xì)胞受到了均勻照射，若不符合，表明細(xì)胞受到了局部照射或非均勻照射。首先對(duì)受1和5 Gyγ射線照射的混合血樣中的MN分布情況作出判斷。結(jié)果如表1所示，在兩個(gè)樣本的1 Gy照射組和5 Gy照射組中，比例為1∶3的混合血樣和比例為3∶1的混合血樣的淋巴細(xì)胞微核分布的|

u|

均大于1.96，

σ

/

y

均大于1，說明不符合泊松分布，為過離散分布。且從表格中

σ

/

y

數(shù)據(jù)可以看出5 Gy照射組的離散程度均大于1 Gy照射組。

表1 離體模擬局部照射情況下人外周血淋巴細(xì)胞MN的分布情況

2.2 混合血中受照血的微核率及受照血比例分析

Dolphin"s模型認(rèn)為在局部照射條件下，染色體畸變?cè)诩?xì)胞間的分布是受照部分的泊松分布與未受照部分過離散分布的疊加。而對(duì)于MN，許多學(xué)者認(rèn)為同樣可以利用Dolphin"s模型計(jì)算混合血中受照血的微核率及受照血比例分析。根據(jù)公式Ⅰ、Ⅱ得出混合血中受照血的微核率及標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)公式Ⅲ得出混合血中受照血的份額：

式中，

y

為混合血中受照細(xì)胞微核率，

x

為觀察到的MN數(shù)，

n

為觀察的雙核淋巴細(xì)胞數(shù)，

n

為不含MN的雙核淋巴細(xì)胞數(shù)，SE為標(biāo)準(zhǔn)差，

F

為混合血中受照血所占的比例，

D

為照射劑量，

D

取值3 Gy。結(jié)果如表2所示，在樣本A的每個(gè)劑量點(diǎn)的1∶3混合組和3∶1混合組中，通過公式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ推算出的混合血中受照血比例

F

與實(shí)際混合血比例均偏差較大，在樣本B中也觀察到了同樣的結(jié)果。

表2 混合血中受照血的微核率及受照血比例分析結(jié)果

2.3 人外周血離體照射模擬局部照射的劑量估算

將混合血樣中受照血的微核率代入劑量效應(yīng)曲線：

y

=17.911 9+33.383 8

D

+42.880 9

D

(

y

為微核率/‰)，估算混合血中受照血的劑量。結(jié)果如表3所示，樣本A和樣本B的1 Gy照射組的估算劑量均與實(shí)際照射劑量偏差較大，二者5 Gy照射組的劑量估計(jì)值與實(shí)際照射劑量較接近。

表3 人外周血離體模擬局部照射的劑量估算結(jié)果

3 討論

本研究以離體情況下人外周血樣品混合不同比例來模擬局部照射，分析混合血樣中微核率，通過Dolphin"s模型和全身均勻照射劑量效應(yīng)曲線估算局部照射劑量。結(jié)果表明在離體情況下，MN能較好地反映局部照射劑量。

由于本研究是離體模擬局部照射，因此需對(duì)混合血中的淋巴細(xì)胞MN作泊松分布

u

檢驗(yàn)，以判斷是否為局部照射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣品各組MN的分布均不符合泊松分布，說明將受照血和未受照血混合可以很好的模擬局部照射。研究發(fā)現(xiàn)同比例下，人外周血淋巴細(xì)胞MN分布的離散程度隨照射劑量的增大而增大。本研究與以往研究相一致，同比例下，離散程度在兩樣本中均為5 Gy照射組大于1 Gy照射組。

由于電離輻射可以造成人外周血淋巴細(xì)胞的間期死亡和有絲分裂延遲，因而受照血淋巴細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)低于未受照血淋巴細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，造成觀察混合血樣本時(shí)，其雙核淋巴細(xì)胞更容易來自未受照血。本研究發(fā)現(xiàn)兩樣本的各組推算的混合血中受照血比例均與實(shí)際混合比例偏差較大。盡管如此，仍可以看出在相同劑量下，樣本A的5 Gy照射組及樣本B的1和5 Gy照射組中，3∶1混合組的受照血比例比1∶3混合組更接近設(shè)定混合比例。因?yàn)榛旌涎惺苷昭壤龃罂梢栽黾邮苷占?xì)胞進(jìn)入有絲分裂的比例，所以起始受照血占比越高，經(jīng)過培養(yǎng)后混合血中受照血的比例更接近設(shè)定比例。因此當(dāng)局部照射部位占全身比例越大，或改善培養(yǎng)條件，使受照細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)越高，對(duì)估算混合血中受照血微核率，進(jìn)而估算局部照射劑量越準(zhǔn)確。

Dolphin"s模型以分布的特征假設(shè)為前提，適用于低LET射線的急性照射條件下的局部照射劑量估算。混合血中受照血的淋巴細(xì)胞MN應(yīng)滿足泊松分布，因此得到混合血中受照血的微核率，即可代入全身劑量效應(yīng)曲線估算受照血的劑量。有研究認(rèn)為MN不適合用于估算局部照射劑量。該研究利用1、2和4 Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞，同樣以照射血和未照射血混合以模擬局部照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各劑量點(diǎn)、各混合比例下MN不能很好地估算局部照射劑量，這可能與其所建立的劑量效應(yīng)曲線有關(guān)。該研究僅用一名女性血樣建立MN劑量效應(yīng)曲線，是造成最終估算結(jié)果偏離實(shí)際值的原因之一。MN自發(fā)率高，受性別、年齡、疾病史、用藥史和生理狀態(tài)等因素的影響。顯然用一例血樣建立曲線是不恰當(dāng)?shù)?。本研究選用衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的劑量效應(yīng)曲線估算受照血?jiǎng)┝?。發(fā)現(xiàn)無論是樣本A還是樣本B，所估算的劑量均為5 Gy照射組接近實(shí)際照射值，而1 Gy照射組的與實(shí)際照射值偏差較大。由于MN自身特點(diǎn)可能對(duì)小于等于1 Gy的劑量估算并不準(zhǔn)確。對(duì)于1 Gy以上特別是2 Gy以上的劑量估算的精確度要求較1 Gy以下的要求高，因?yàn)? Gy以上劑量產(chǎn)生的組織反應(yīng)會(huì)帶來很高的健康風(fēng)險(xiǎn)。故在1 Gy以上范圍MN能否很好的估算局部劑量還需增加劑量點(diǎn)以進(jìn)一步研究。

綜上所述，離體情況下，MN能較好的用于估算局部照射劑量。但由于MN的自發(fā)率較高，影響因素多，故對(duì)較低局部劑量的估算可能存在較大偏差。另外離體局部照射是對(duì)在體局部照射或不均勻照射的簡單模擬，在體局部照射涉及諸多影響因素，因此還需進(jìn)一步研究建立MN在體局部照射劑量估算的方法。