利用全胚胎和微團(tuán)培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)硝酸鈰的發(fā)育毒性

劉青云，康陳萍，肖倩倩，郝衛(wèi)東

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系/食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

稀土元素是元素周期表中IIIB族的釔和鑭系元素的總稱，鈰是稀土元素中豐度最高、應(yīng)用最為廣泛的元素。我國(guó)是稀土資源大國(guó)，儲(chǔ)量、生產(chǎn)和出口均列全球之首，隨著開(kāi)采及使用的增加，鈰元素等稀土的職業(yè)暴露、環(huán)境暴露、醫(yī)源性暴露隨之加大。監(jiān)測(cè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東礦區(qū)、江西輕稀土礦和江西重稀土礦區(qū)礦工頭發(fā)中稀土含量超對(duì)照組6～16倍。稀土礦區(qū)小學(xué)生尿液中檢出的稀土元素含量明顯高于非礦區(qū)學(xué)生。同時(shí)礦區(qū)內(nèi)自然生活環(huán)境稀土元素暴露嚴(yán)重，空氣、生活飲用水以及土壤中鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)中位數(shù)分別為0.164μg/m、0.164μg/L和75.413 mg/kg，均顯著高于對(duì)照區(qū)。研究表明礦區(qū)周圍市售水果、蔬菜、糧食、茶葉、肉類、鮮凍水產(chǎn)品中均含有稀土元素，其中以茶葉中所含稀土元素最高。在2017年一項(xiàng)調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，江西某地的茶葉中稀土元素的含量平均值3.06 mg/kg，檢出率100%、超標(biāo)率達(dá)到了49.6%，其中鈰元素含量最高達(dá)到了0.85 mg/kg，占稀土總量的31%。稀土元素長(zhǎng)期攝入會(huì)在相關(guān)器官蓄積引起神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等全身性、多系統(tǒng)的健康損害。其中生殖發(fā)育系統(tǒng)對(duì)化學(xué)物的毒性作用非常敏感，稀土元素可透過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，因此鈰元素等稀土的安全性問(wèn)題及胚胎發(fā)育毒性引起了社會(huì)極大關(guān)注。早期資料報(bào)道，稀土元素可以造成死胎率、畸胎率升高，引起胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及器官的不可逆損傷。但目前單一稀土元素鈰的胚胎發(fā)育毒理學(xué)資料尚不夠完整。

隨著動(dòng)物福利3R(replace，redcuce，refine)原則的推進(jìn)以及大量新化合物的出現(xiàn)，毒理學(xué)替代方法受到廣泛重視。體外替代實(shí)驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、周期短、劑量-反應(yīng)關(guān)系易測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已普遍應(yīng)用于發(fā)育毒性的篩選和致畸機(jī)制的研究?，F(xiàn)已有3種體外模型，即全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)(whole embryo culture test，WEC)、微團(tuán)檢測(cè)試驗(yàn)(micromass test，MM)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)于2003年正式通過(guò)歐洲替代方法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)驗(yàn)證，并作為發(fā)育毒性的篩選方法。本研究擬補(bǔ)充稀土元素鈰的胚胎發(fā)育毒理學(xué)資料，參考ECVAM植入后全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型，評(píng)價(jià)硝酸鈰的胚胎發(fā)育毒性，為進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究及合理制定人群稀土接觸的健康指導(dǎo)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

SD大鼠(雄性280～300 g，雌性220～240 g)，北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(合格證號(hào)11804700015381)。大鼠在晝/夜循環(huán)12/12 h，溫度20～24℃，濕度50%～60%的封閉環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，每日18:00將SD大鼠按雌、雄2∶1比例合籠，次日7:00進(jìn)行陰道涂片，鏡下查見(jiàn)精子視為受孕成功，當(dāng)天定為孕第0天(GD0)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理分會(huì)審查批準(zhǔn)。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞BALB/c 3T3細(xì)胞系，由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心贈(zèng)送。

1.2 主要試劑與儀器

硝酸鈰(純度大于99.999%)、Ham"s F-12培養(yǎng)基、臺(tái)盼藍(lán)、中性紅、阿利新藍(lán)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Thermo公司(Gibco系列)；胰蛋白酶(1∶250)購(gòu)于美國(guó)BD公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(tetrazolium bromide，MTT)、鹽酸胍、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；胎牛血清購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括：體視顯微鏡(OLYMPUS公司SZX2-ILLT型)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱(Gold-SIM公司Hp11型雜交箱改裝)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司HERA cell型)，酶標(biāo)儀(Omega公司FLUOstar Omega型)，低溫離心機(jī)(Heraeus公司Biofuge Stratos型)，顯微鏡和顯微鏡成像設(shè)備(Nikon公司TE2000-S型顯微鏡和Motic公司2000型成像設(shè)備)。

1.3 植入后全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 全胚胎培養(yǎng)

根據(jù)實(shí)際受孕情況，每次取1～3只受孕9.5 d(GD9.5)的SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在無(wú)菌環(huán)境下暴露腹腔取出子宮，剪開(kāi)子宮分離蛻膜團(tuán)，將胚胎從蛻膜團(tuán)中剖開(kāi)，在體視顯微鏡下剝除Reichert"s膜，選擇含3～5個(gè)初始體節(jié)、外形充盈的胚胎，將胚胎隨機(jī)分為4組，每組放入2～3只胚胎。試驗(yàn)共取用8只孕鼠，每個(gè)劑量組至少7只胚胎。將4 mL預(yù)溫的大鼠即刻離心血清及相應(yīng)濃度的硝酸鈰加入50 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃、40 r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在模型允許的范圍內(nèi)，將胚胎畸形率達(dá)100%時(shí)的受試物濃度作為最高濃度，對(duì)胚胎生長(zhǎng)無(wú)明顯作用時(shí)的濃度作為最低濃度，按一定的濃度梯度進(jìn)行稀釋，硝酸鈰最終染毒濃度分別為0.00、0.50、0.75和1.00 mmol/L。分別于開(kāi)始培養(yǎng)前(10%O，5%CO，85%N)、培養(yǎng)至第16小時(shí)(20%O，5%CO，75%N)、第26小時(shí)(40%O，5%CO，55%N)進(jìn)行3次充氣，每次充氣時(shí)間2.5 min。胚胎培養(yǎng)48 h后，選擇仍有心跳及血液循環(huán)的胚胎，測(cè)定其卵黃囊直徑(yolk sac diameter，YSD)、頂 臀 長(zhǎng)(crown-rump length，CRL)、頭長(zhǎng)(head length，HL)、體節(jié)數(shù)等生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，根據(jù)Brown"s評(píng)分法對(duì)胚胎卵黃囊、尿囊、體屈、心、腦、視聽(tīng)嗅系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等器官的形態(tài)學(xué)發(fā)育情況進(jìn)行評(píng)分(total morphological score，TMS)并記錄特定畸形。計(jì)算50%的胚胎出現(xiàn)畸形的濃度(IC)、對(duì)總體形態(tài)學(xué)評(píng)分未見(jiàn)異常效應(yīng)的最高濃度(IC)、最大比率出現(xiàn)畸形的最低濃度(IC)。

1.3.2 BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

取細(xì)胞濃度為5×10個(gè)/mL的BALB/c 3T3細(xì)胞懸液，以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)2 h待細(xì)胞貼壁后加入硝酸鈰染毒液(0.00、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L)。第3天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6天用MTT法檢測(cè)BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性，并計(jì)算50%的BALB/c 3T3細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的受試物濃度(IC)。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.3.3 發(fā)育毒性預(yù)測(cè)

利用ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測(cè)模型(prediction model，PM)PM1和PM2對(duì)胚胎發(fā)育毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。PM1判別式如下：

判別式I 18.08×lg(IC)-11.56×lg(IC)-10.19

判別式II 21.55×lg(IC)-15.31×lg(IC)-10.65

判別式III 8.70×lg(IC)-8.53×lg(IC)-2.53

PM2判別式如下：

判別式I 0.21×[(IC-IC)/IC]×100＋15.37×log(IC)-23.58

判別式II 0.27×[(IC-IC)/IC]×100＋17.71×log(IC)-32.37

判別式III 0.093×[(IC-IC)/IC]×100＋4.21×log(IC)-4.23

若判別式I的值高于判別式II和判別式III，判定化合物為無(wú)胚胎發(fā)育毒性；若判別式II的值高于判別式I和判別式III，判定化合物為弱胚胎發(fā)育毒性；若判別式III的值高于判別式I和判別式II，判定化合物為強(qiáng)胚胎發(fā)育毒性。

1.4 微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)

1.4.1 微團(tuán)培養(yǎng)

取1只孕13 d(GD13)孕鼠，無(wú)菌條件下取出子宮，剝離胚胎，撕脫蛻膜和Reichert"s膜，選擇體節(jié)數(shù)為40～45的胚胎分離肢芽。將肢芽用PBS清洗3遍后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min。加入Ham"s F-12完全培養(yǎng)液終止消化并清洗3次后，重懸吹打至單細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾后計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整肢芽細(xì)胞濃度為2×10個(gè)/mL，以5μL/孔點(diǎn)種于96孔培養(yǎng)板每孔中央，培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，待細(xì)胞貼壁后每孔加入200μL含相應(yīng)濃度硝酸鈰的完全培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d。將該模型適用的最高檢測(cè)濃度1 000μg/mL(相當(dāng)于硝酸鈰3.00 mmol/L)作為本研究受試物的最高濃度，并按照一定的梯度進(jìn)行稀釋。硝酸鈰終濃度為0.00、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.4.2 微團(tuán)細(xì)胞增殖分化檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)第5天，棄培養(yǎng)液加入200μL 0.005%中性紅染液，37℃孵育3 h。棄中性紅，生理鹽水清洗3次后加入甲醛鈣200 μL，1 min后去除甲醛鈣，加入200μL酸性乙醇搖床提取60 min，于酶標(biāo)儀540 nm進(jìn)行比色測(cè)量吸光度值。計(jì)算50%細(xì)胞增殖活性被抑制時(shí)的濃度(IC)。

微團(tuán)細(xì)胞用生理鹽水清洗3次，洗去96孔板內(nèi)的中性紅，加入200μL 1%阿利新藍(lán)染色液常溫過(guò)夜。去阿利新藍(lán)液，生理鹽水清洗3次后，計(jì)數(shù)微團(tuán)數(shù)量，6 mol/L的鹽酸胍提取2 h后于酶標(biāo)儀620 nm進(jìn)行比色測(cè)量吸光度值。計(jì)算50%細(xì)胞分化及集落形成受抑制時(shí)的濃度(ID)。

1.4.3 胚胎毒性預(yù)測(cè)

ECVAM微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)的胚胎毒性預(yù)測(cè)模型包括3個(gè)判別式，判別標(biāo)準(zhǔn)同1.3.3。

判別式I 6.65×lg(ID)-9.49

判別式II 6.16×lg(ID)-8.29

判別式III 1.31×lg(ID)-1.42

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)方差齊性時(shí)，用單因素方差分析(one way ANOVA)并用LSD及Dunnett-

t

法進(jìn)行兩兩比較。若方差不齊，用Dunnett"s

C

和Games-Howell進(jìn)行多重比較。用Linearby-Linear Association法進(jìn)行劑量相關(guān)趨勢(shì)性檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IC及ID用GraphPad Prism 7擬合計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 利用全胚胎培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)硝酸鈰的發(fā)育毒性

2.1.1 硝酸鈰對(duì)胚胎生長(zhǎng)的影響

0.75 mmol/L及以上濃度硝酸鈰染毒組的胚胎卵黃囊直徑、頂臀長(zhǎng)均較對(duì)照組明顯減小，1 mmol/L硝酸鈰染毒顯著減少胚胎頭長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05，圖1)。提示較高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致大鼠胚胎生長(zhǎng)遲緩。

圖1 硝酸鈰對(duì)胚胎生長(zhǎng)的影響

在體視顯微鏡下觀察，可見(jiàn)對(duì)照組胚胎卵黃囊血管豐富、形態(tài)清晰，胚胎形態(tài)發(fā)育正常；0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊直徑相對(duì)較小，卵黃囊表面血管稍欠充盈，頭長(zhǎng)與頂臀長(zhǎng)減??；1.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊直徑進(jìn)一步減小，頭長(zhǎng)與頂臀長(zhǎng)明顯減小，部分胚胎體屈不足、背中線不規(guī)則，抑制了胚胎的生長(zhǎng)(圖2)。

圖2 硝酸鈰對(duì)胚胎形態(tài)發(fā)育的影響

2.1.2 硝酸鈰對(duì)胚胎發(fā)育的影響

0.00、0.50、0.75、1.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎總體形態(tài)學(xué)評(píng)分(圖3)分別為50.82、49.83、47.38和46.50。其中0.75 mmol/L及以上硝酸鈰染毒組的胚胎總體形態(tài)學(xué)評(píng)分和體節(jié)數(shù)均較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，提示較高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩。

根據(jù)Brown"s評(píng)分法對(duì)胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分，結(jié)果如表1所示。0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎出現(xiàn)了后腦和后肢芽發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為前神經(jīng)孔未閉合、后肢芽缺失。1.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊血管、中腦和后肢芽均出現(xiàn)發(fā)育畸形，提示較高濃度的硝酸鈰可能對(duì)大鼠胚胎的血管發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

圖3 硝酸鈰對(duì)胚胎總體形態(tài)學(xué)評(píng)分和體節(jié)數(shù)的影響

表1 硝酸鈰對(duì)大鼠胚胎各器官系統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)分的影響(±s)

2.1.3 全胚胎培養(yǎng)模型對(duì)硝酸鈰發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)

經(jīng)BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)測(cè)得硝酸鈰對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞的IC為1.52 mmol/L(495.52 μg/mL)。同時(shí)經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線擬合，計(jì)算出全胚胎培養(yǎng)模型中硝酸鈰的IC為0.72 mmol/L(235.70μg/mL)，IC為0.50 mmol/L(163.06μg/mL)，IC為1.00 mmol/L(326.12μg/mL)。將評(píng)價(jià)指標(biāo)代入ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測(cè)模型1(PM1)，判別式I的值大于判別式II和判別式III，評(píng)價(jià)硝酸鈰為無(wú)胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物；代入ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測(cè)模型2(PM2)，判別式II的值大于判別式I和判別式III(表2)，評(píng)價(jià)硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。

2.2 利用微團(tuán)培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)硝酸鈰的發(fā)育毒性

2.2.1 硝酸鈰對(duì)肢芽細(xì)胞增殖和分化的影響

在同期實(shí)驗(yàn)中以5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照對(duì)微團(tuán)培養(yǎng)模型進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)判定5-氟尿嘧啶為強(qiáng)發(fā)育毒性物質(zhì)，符合模型建立標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)微團(tuán)培養(yǎng)模型建立成功。在本研究中0.50 mmol/L及以上濃度的硝酸鈰可顯著降低大鼠肢芽細(xì)胞增殖能力，0.25 mmol/L硝酸鈰可降低肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的能力，1.00 mmol/L及以上濃度的硝酸鈰可抑制微團(tuán)形成數(shù)目(圖4)。

表2 全胚胎培養(yǎng)模型硝酸鈰的判別公式計(jì)算結(jié)果

與對(duì)照組相比，1.00 mmol/L硝酸鈰組大鼠胚胎肢芽微團(tuán)形成數(shù)目明顯降低，隨硝酸鈰劑量升高，大鼠胚胎肢芽微團(tuán)數(shù)目逐漸減少，單個(gè)微團(tuán)體積逐漸變小，軟骨細(xì)胞阿利新藍(lán)著色度逐漸降低，至2.00 mmol/L組已無(wú)微團(tuán)形成(圖5)。

圖4 硝酸鈰對(duì)肢芽細(xì)胞增殖和分化的影響

圖5 硝酸鈰對(duì)肢芽微團(tuán)分化的影響

2.2.2 微團(tuán)培養(yǎng)模型對(duì)硝酸鈰發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)

經(jīng)計(jì)算硝酸鈰對(duì)肢芽細(xì)胞增殖的IC為1.23 mmol/L(400.65μg/mL)。硝酸鈰對(duì)肢芽細(xì)胞分化的ID為0.76 mmol/L(247.76μg/mL)，代入微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測(cè)判別式，評(píng)價(jià)硝酸鈰為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。

3 討論

近30年來(lái)全球?qū)ο⊥恋男枨罅恳悦磕?.7%～8.6%的速度增加。鈰在眾稀土元素中豐度最高，在地殼中的含量約0.004 6%，由于其特殊的理化性質(zhì)和良好的生物活性，鈰在很多領(lǐng)域大量應(yīng)用。鈰元素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致在人群中長(zhǎng)期暴露蓄積，且鈰能通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，毒性作用不僅影響母體本身，還影響其后代。因此鈰元素對(duì)于人體健康的影響尤其對(duì)胚胎的發(fā)育毒性需要引起特別重視。但目前關(guān)于鈰元素發(fā)育毒性的研究報(bào)道還不夠全面，主要存在以下幾點(diǎn)不足：①稀土元素發(fā)育毒性資料集中于早期，而早期評(píng)價(jià)方法技術(shù)有限、規(guī)范性不夠；②目前的研究多集中于混合稀土元素的毒性研究，缺乏對(duì)單一稀土元素鈰的深入探索；③在重視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及3R原則的時(shí)代背景下，應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)毒理學(xué)替代方法，綜合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)鈰元素進(jìn)行全面生殖發(fā)育毒性評(píng)價(jià)。

本研究參考ECVAM植入后全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型，評(píng)價(jià)硝酸鈰的胚胎發(fā)育毒性。全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)是以體外胚胎替代整體動(dòng)物，模擬胚胎發(fā)育早期(GD9.5～GD11.5)對(duì)受試物的暴露過(guò)程，主要用于研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)器官的早期生長(zhǎng)發(fā)育影響和胚胎毒性。微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)是通過(guò)經(jīng)受試物暴露的胚胎肢芽原代細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，對(duì)肢芽細(xì)胞增殖能力及向軟骨細(xì)胞分化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育中、晚期(GD13～GD18)潛在發(fā)育毒性。ECVAM的驗(yàn)證結(jié)果顯示，全胚胎培養(yǎng)模型PM1和PM2對(duì)化學(xué)物發(fā)育毒性預(yù)測(cè)的總體準(zhǔn)確性分別為68%和80%，微團(tuán)培養(yǎng)模型預(yù)測(cè)的總體準(zhǔn)確性為70%。

本研究中，全胚胎培養(yǎng)模型預(yù)測(cè)模型PM1判定硝酸鈰為無(wú)胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物，PM2判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。根據(jù)ECVAM的驗(yàn)證結(jié)果，PM1只考慮分化和發(fā)育的參數(shù)，而PM2納入了3T3細(xì)胞毒性測(cè)試的數(shù)據(jù)以評(píng)價(jià)化學(xué)物母體毒性，PM2對(duì)于無(wú)、弱、強(qiáng)胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物的準(zhǔn)確性分別為70%、76%、100%，均高于PM1(56%、75%、79%)，對(duì)于化學(xué)物發(fā)育毒性的預(yù)測(cè)結(jié)果更為全面準(zhǔn)確。因此本研究全胚胎培養(yǎng)模型可判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。根據(jù)微團(tuán)培養(yǎng)的預(yù)測(cè)模型判別式，判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物，經(jīng)ECVAM驗(yàn)證微團(tuán)試驗(yàn)對(duì)弱胚胎毒性化學(xué)物的預(yù)測(cè)符合率為71%。綜合全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型的判定結(jié)果，可認(rèn)為硝酸鈰具有潛在的胚胎發(fā)育毒性，為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。

本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)硝酸鈰對(duì)大鼠胚胎生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，全胚胎培養(yǎng)模型中，0.75 mmol/L以上濃度的硝酸鈰染毒導(dǎo)致胚胎卵黃囊直徑、頂臀長(zhǎng)、頭長(zhǎng)均明顯減小，具有明顯的生長(zhǎng)遲滯效應(yīng)，表明了高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)遲緩。近幾年流行病學(xué)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)稀土元素鈰與新生兒出生結(jié)局相關(guān)。黃敏在隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)孕婦孕晚期尿中稀土元素鈰的濃度與新生兒出生體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，與新生兒發(fā)生小于胎齡兒的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。同時(shí)在一項(xiàng)前瞻性出生隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前鈰的暴露與新生兒促甲狀腺激素水平呈負(fù)相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也報(bào)道了ICR小鼠孕16、17 d尾靜脈染毒納米和微米氧化鈰(30 mg/kg)會(huì)影響胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量下降。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)1.00 mmol/L硝酸鈰染毒可顯著影響胚胎卵黃囊血管的發(fā)育。臟層卵黃囊是胚胎早期造血循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)獲得的重要器官，在絨毛膜尿囊胎盤形成前，胚胎卵黃囊血管形成于卵黃囊間充質(zhì)層，是母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流向胎兒循環(huán)的直接途徑。本實(shí)驗(yàn)中硝酸鈰對(duì)胚胎卵黃囊血管的發(fā)育抑制可能是造成大鼠胚胎生長(zhǎng)遲緩的原因之一，其具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

在本次全胚胎培養(yǎng)模型中，對(duì)胚胎各器官系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，0.75 mmol/L硝酸鈰染毒可導(dǎo)致胚胎后腦發(fā)育畸形，1.00 mmol/L染毒組則出現(xiàn)中腦發(fā)育畸形。腦的發(fā)育起源分為前腦、中腦、后腦三個(gè)區(qū)域，中腦在腦干的最前方，和視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及溫度調(diào)控等有關(guān)。后腦由腦橋、延髓，以及小腦組成，且神經(jīng)管發(fā)育是從后腦開(kāi)始閉合。提示硝酸鈰對(duì)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定影響。Wei等的病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)孕婦血清中鈰的濃度與胎兒神經(jīng)管畸形風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SD大鼠在孕第7～16天灌胃硝酸鑭(60 mg/kg)，顯著降低了仔鼠握力及后肢力量，影響Morris水迷宮測(cè)試中的記憶和空間學(xué)習(xí)能力，同時(shí)增加了熱板實(shí)驗(yàn)中的疼痛反應(yīng)潛伏期。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)氧化鈰納米顆粒可以抑制人源神經(jīng)干細(xì)胞(hNPC)和鼠源神經(jīng)干細(xì)胞(C17.2)的分化，顯著性減少神經(jīng)元特異性β3-微管蛋白表達(dá)，改變神經(jīng)元生長(zhǎng)錐結(jié)構(gòu)。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)鈰對(duì)中腦和后腦的毒性作用表明高劑量的稀土元素對(duì)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

此外稀土元素對(duì)胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育也存在影響。早期研究發(fā)現(xiàn)，混合稀土于大鼠妊娠第6～15天染毒，導(dǎo)致高劑量組(1 428 mg/kg)胎鼠上枕骨、胸骨、前后爪骨發(fā)育級(jí)別明顯降低，顱骨后囟和矢狀縫寬度顯著增寬。人群研究也發(fā)現(xiàn)礦區(qū)居民稀土元素暴露積累，由于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合導(dǎo)致鐵和鈣含量降低，導(dǎo)致骨骼代謝紊亂，骨密度降低。對(duì)于單一稀土元素鈰的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，鈰對(duì)骨骼系統(tǒng)發(fā)育具有雙向作用，即低劑量鈰促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育，高劑量鈰抑制成骨細(xì)胞分化礦化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雄性昆明小鼠60 d硝酸亞鈰(60 mg/kg)染毒造成胎仔骨骼畸形率上升。本研究微團(tuán)培養(yǎng)模型中，0.50 mmol/L濃度硝酸鈰抑制大鼠肢芽細(xì)胞增殖，0.25 mmol/L硝酸鈰可顯著降低肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的能力，硝酸鈰可能導(dǎo)致大鼠胚胎肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞過(guò)程受阻。同時(shí)在全胚胎培養(yǎng)模型中0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組出現(xiàn)了后肢芽發(fā)育畸形。肢芽是四肢發(fā)生初期階段身體兩側(cè)的芽狀突起，其內(nèi)部中胚層可分化為軟骨、骨骼、肌肉等。結(jié)合兩個(gè)模型中硝酸鈰對(duì)胚胎肢芽分化的抑制效應(yīng)，提示高濃度鈰可抑制胚胎的骨骼系統(tǒng)發(fā)育。

在本研究組同期試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，全胚胎培養(yǎng)模型硝酸鑭對(duì)胚胎生長(zhǎng)的無(wú)可見(jiàn)有害作用水平(no-observed-adverse-effect level，NOAEL)為0.12 mmol/L，經(jīng)預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。在微團(tuán)培養(yǎng)模型硝酸鑭對(duì)肢芽細(xì)胞增殖活性的NOAEL為1.00 mmol/L，對(duì)肢芽細(xì)胞分化能力的NOAEL為0.25 mmol/L，被評(píng)價(jià)為無(wú)胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。而在本次實(shí)驗(yàn)中，硝酸鈰對(duì)胚胎生長(zhǎng)的NOAEL為0.50 mmol/L，對(duì)肢芽細(xì)胞增殖活性及肢芽細(xì)胞分化能力的NOAEL分別為0.25 mmol/L、0.12 mmol/L。上述結(jié)果表明，在全胚胎培養(yǎng)模型中硝酸鈰的毒性弱于硝酸鑭，在微團(tuán)培養(yǎng)模型中硝酸鈰表現(xiàn)出更強(qiáng)抑制作用，提示胚胎發(fā)育早期，胚胎對(duì)硝酸鑭更敏感，而發(fā)育中、晚期的胚胎對(duì)硝酸鈰易感。Oral等在稀土元素對(duì)海洋生物發(fā)育毒性的研究中也發(fā)現(xiàn)，鈰與鑭相比較，對(duì)海膽的胚胎毒性、遺傳毒性更敏感。由此，不同稀土元素發(fā)育毒性的差異及健康效應(yīng)仍需進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

本研究采用全胚胎培養(yǎng)模型與微團(tuán)培養(yǎng)模型模擬胚胎發(fā)育過(guò)程，初步認(rèn)為硝酸鈰在胚胎發(fā)育早期及中、晚期均具有潛在的胚胎發(fā)育毒性，對(duì)大鼠胚胎的生長(zhǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響，經(jīng)判定為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。盡管胚胎毒性體外替代試驗(yàn)已在毒物篩查和機(jī)制研究中廣泛應(yīng)用，但仍存在一定局限性，體外細(xì)胞、組織、器官以及胚胎的代謝能力有限，體內(nèi)外毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)不完全一致，不能完全代表哺乳動(dòng)物發(fā)育全過(guò)程。另外胚胎毒性體外替代試驗(yàn)?zāi)壳皟H用于受試物是否具有胚胎發(fā)育毒性的判斷，尚未和實(shí)際暴露劑量進(jìn)行聯(lián)系。因此對(duì)硝酸稀土的發(fā)育毒性及其接觸風(fēng)險(xiǎn)還需要結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證。