miR-210通過NF-κB信號通路影響宮頸癌Hela細胞惡性生物學(xué)行為

羅茹蓉 張桂蕓 姚文香 雒鈺花 吳梅仙 (白銀市第二人民醫(yī)院婦科，甘肅 白銀 730900)

宮頸癌(CC)是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性癌癥相關(guān)死亡率的主要原因〔1〕。在過去幾十年中，隨著CC組織的病理檢查的改善和早期診斷的應(yīng)用，CC的發(fā)病率和死亡率顯著降低，但晚期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者5年生存率僅5%～15%〔2〕。目前，CC的主要治療方法是手術(shù)、化療和放療，盡管目前人們在治療和預(yù)防方面付出了巨大努力，但患者預(yù)后仍不能令人滿意。因此，充分了解CC的發(fā)生和發(fā)展的機制，對識別和篩選CC早期診斷和臨床治療的分子標志物具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小的非編碼RNA，長度18～22個核苷酸，其與相關(guān)靶mRNA的3′-UTR相互作用，通過直接和間接影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過程來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。近年來，據(jù)報道m(xù)iRNA在一些參與腫瘤發(fā)生的事件中起重要作用，如細胞存活、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移〔3，4〕。研究表明，miR-210在人類不同的腫瘤中發(fā)揮致癌的作用，如結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和膀胱癌等〔5～7〕。據(jù)報道，miR-210能夠促進前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和骨轉(zhuǎn)移，該過程與核因子(NF)-κB信號通路密切相關(guān)〔8〕。然而，miR-210在CC細胞惡性生物學(xué)行為中的作用仍然未知。本實驗通過檢測miR-210在CC細胞中的表達，探究其對Hela細胞惡性生物學(xué)行為的影響及可能的機制，以期為CC的早期診斷和靶向治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常宮頸上皮細胞H8和CC細胞Hela、caski、siha和c4-1均購自美國ATCC細胞庫；胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；miR-210 inhibitor及inhibitor Control購自廣州市銳博生物科技有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)測定試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡測定試劑盒購自日本TaKaRa公司；噻唑藍(MTT)試劑和二甲基亞砜均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Coring公司；細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自碧云天生物科技研究所；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)和酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，將細胞放置在含5%CO2、相對濕度95%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長密度達80%以上時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將對數(shù)生長期的Hela細胞接種到6孔板中，每孔接種2×105個細胞，置培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細胞達50%～60%融合時，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor或inhibitor Control，將細胞分為空白對照(Control)組、陰性對照(anti-NC)組和實驗(anti-miR-210)組，各組Hela細胞置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-210的表達水平 分別收集處于對數(shù)生長期的H8、Hela、caski、siha、c4-1細胞和轉(zhuǎn)染48 h后各組Hela細胞，TRIzol法提取各細胞中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應(yīng)條件為：94℃ 3 min，94℃ 15 s，56℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用相對定量2-△△Ct法計算miR-210相對表達水平。

1.4CCK-8法檢測Hela細胞增殖情況 對數(shù)期的Hela細胞接種到96孔板中，細胞接種密度為5×103個/孔，待細胞貼壁生長后按照1.2進行轉(zhuǎn)染，每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔，在轉(zhuǎn)染48 h時，向每孔細胞中緩慢加入10 μl CCK-8溶液，避免氣泡產(chǎn)生，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，使用酶標儀測定波長為450 nm處光密度值(OD值)，實驗重復(fù)3次。

1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 Hela細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓處理16 h，分別收集各組細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，每個Transwell小室的上室(侵襲實驗Transwell小室的上室預(yù)先用Matrigel膠包被，遷移實驗Transwell小室的上室不以Matrigel膠包被)加入100 μl細胞懸液，在下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用90%乙醇固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦去上室未穿膜的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，風(fēng)干，在顯微鏡低倍鏡(×100)下隨機選取5個視野進行觀察，并記錄細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組Hela細胞，用預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，離心收集約1×106個細胞，加入結(jié)合緩沖液100 μl重懸細胞，向細胞懸液中加入FITC-AnnexinⅤ溶液5 μl，輕輕混勻，孵育15 min，再向細胞中加入PI染液5 μl，混勻后避光反應(yīng)15 min，使用上流式細胞儀檢測各組Hela細胞凋亡情況，實驗重復(fù)3次。

1.7Western印跡檢測蛋白表達水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組Hela細胞，加入適量細胞裂解液，置冰上提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白樣品濃度，取30 μg蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封阻1 h，分別加入一抗4℃過夜雜交，Bcl-2一抗(1∶500)，Bax一抗(1∶500)，酶切Caspase-3一抗(1∶500)，IκBα一抗(1∶500)，p-IκBα一抗(1∶500)，NF-κB一抗(1∶500)，p-NF-κB一抗(1∶500)。PBST洗滌3次(每次10 min)，加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫雜交2 h。PBST洗滌3次(每次10 min)，以ECL試劑顯影，以β-actin標定，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-210在CC細胞中表達水平升高 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Hela細胞(3.52±0.38)、caski細胞(2.44±0.25)、siha細胞(2.59±0.28)和c4-1細胞中miR-210的表達水平(1.94±0.20)顯著高于正常宮頸上皮H8細胞(1.00±0.10，P<0.05)。在Hela細胞中的表達水平最高，后續(xù)采用Hela細胞開展功能實驗。

2.2miR-210 inhibitor轉(zhuǎn)染效率檢測 anti-miR-210組Hela細胞中miR-210表達水平(0.31±0.03)明顯低于Control組(1.00±0.11)和anti-NC組(1.00±0.09，P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞中miR-210表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3敲減miR-210抑制Hela細胞增殖、侵襲和遷移能力 CCK-8實驗結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細胞OD值明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示，anti-miR-210組侵襲和遷移細胞數(shù)明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組侵襲和遷移細胞數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。

圖1 敲減miR-210對Hela細胞侵襲和遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 敲減miR-210對Hela細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

2.4敲減miR-210促進Hela細胞凋亡 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細胞凋亡率明顯高于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平明顯高于Control組和anti-NC組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表2和圖3。

圖2 流式細胞儀檢測各組Hela細胞凋亡率

組別凋亡率(%)Bcl-2Bax酶切Caspase-3Control組5.31±0.680.76±0.080.11±0.010.04±0.01anti-NC組5.42±0.660.74±0.070.10±0.010.03±0.01anti-miR-210組19.26±2.111)2)0.30±0.031)2)0.52±0.061)2)0.68±0.071)2)F/P值108.267/0.00049.869/0.000136.026/0.000244.765/0.000

圖3 Western印跡檢測各組Hela細胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平

2.5敲減miR-210抑制NF-κB信號通路的激活 Western印跡檢測結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細胞中p-IκBα和p-NF-κB蛋白表達水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)，IκBα和NF-κB蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)；Control組和anti-NC組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表3。

圖4 Western印跡檢測各組Hela細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平

表3 各組Hela細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達異常不僅能夠調(diào)控腫瘤細胞無限增殖還可影響細胞侵襲和轉(zhuǎn)移〔9，10〕。因此，深入探究miRNA的生物學(xué)功能為惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療提供新的方向。以往研究顯示，miR-210在人類多種腫瘤中呈高表達，作為致癌基因，miR-210能夠靶向調(diào)控基因表達或信號通路的活化。如Liu等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在骨肉瘤組織中的表達顯著高于其配對正常組織，體外功能實驗結(jié)果顯示，miR-210可通過直接靶向成纖維細胞生長因子受體樣(FGFRL)1促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲。Luan等〔12〕研究顯示，miR-210通過靶向Bcl-2腺病毒E1B相互作用蛋白(BNIP)3保護腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12細胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷，此外該過程涉及PI3K/AKT/mTOR信號通路。陽寧等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在前列腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，其可通過下調(diào)BNIP3的表達抑制前列腺癌PC-3細胞凋亡。并且miR-210的表達升高與腎癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后不良有關(guān)〔14～16〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在宮頸癌組織中異常高表達，然而關(guān)于miR-210在宮頸癌中的功能及作用機制尚不清楚〔17〕。

有研究指出，miR-210作為致癌基因可通過上調(diào)Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平促進膠質(zhì)瘤U87細胞的凋亡〔18〕。另一項研究表明，miR-210可通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白表達水平影響卵巢癌OVCAR3和SKOV3細胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果顯示，敲減miR-210后細胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達水平明顯下調(diào)，這與以往研究一致。提示敲減miR-210可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達水平促進細胞凋亡。研究表明，NF-κB信號通路在人類多種類型的癌癥中異常激活，這與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。例如，在CC中，NF-κB信號的異常激活與CC的預(yù)后不良密切相關(guān)；抑制NF-κB信號通路能夠抑制CC細胞增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡〔20～22〕。在靜息的細胞中，NF-κB和IκB結(jié)合形成復(fù)合體，以無活性形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞受外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化暴露NF-κB核定位位點，NF-κB轉(zhuǎn)位至細胞核，進而調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達〔23〕。本研究結(jié)果提示過表達miR-210可能抑制NF-κB信號通路的激活。Zhang等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210通過靶向死亡受體(DR)6抑制NF-κB信號通路影響軟骨細胞活力和細胞凋亡。結(jié)合Zhang等〔24〕和Ren等〔8〕研究提示miR-210可能通過調(diào)控NF-κB信號通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明miR-210可能通過調(diào)控NF-κB信號通路影響CC Hela細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。

總之，本研究結(jié)果表明miR-210在CC細胞中呈高表達，敲減CC Hela細胞中miR-210的表達能夠通過抑制NF-κB信號通路的激活抑制細胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細胞凋亡。提示miR-210可能有望成為CC靶向治療的新靶點。