RTN1-C基于Nogo-A/RhoA/ROCK2信號通路對腦卒中模型大鼠認(rèn)知功能的干預(yù)作用

郭丹 高兵 欒梅

(1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121000;2遼寧錦州古塔區(qū)醫(yī)院院辦;3錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院老年科)

腦卒中是由腦血管破裂、局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致患者腦組織因缺血、缺氧而發(fā)生壞死的一種疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類生命健康，且腦卒中后會遺留一些嚴(yán)重的并發(fā)癥〔1,2〕，如言語障礙、認(rèn)知障礙、記憶力減退，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)蛋白(RTN1)稱為神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白，在腦組織中的表達(dá)量最多，可減輕腦梗死腦組織的損傷程度，其作用機(jī)制與機(jī)體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)和各種通路蛋白相關(guān)聯(lián)〔3〕。髓鞘相關(guān)生長抑制因子(Nogo-A)可參與神經(jīng)細(xì)胞遷移和擴(kuò)散，在阻止軸突再生和腦卒中后軸突重建方面具有非常重要的作用〔4,5〕。有效抑制Rho激酶(Rho)A的水平可促進(jìn)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)突的生長與神經(jīng)元的分化。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，活化的Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶(ROCK)會影響神經(jīng)炎癥和多巴胺能神經(jīng)變性，因此，抑制ROCK可調(diào)節(jié)軸突生長水平，保護(hù)神經(jīng)元不受傷害〔6〕。本文分析RTN1-C基于Nogo-A/RhoA/ROCK2信號通路對腦卒中模型大鼠認(rèn)知功能的干預(yù)作用。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取清潔級健康雄性大鼠48只，鼠齡2～3個月，平均鼠齡(2.63±0.22)個月，體重250～330 g，平均體重(305.26±8.24)g，大鼠由廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所提供，許可批號：SCXK 2018-0044。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度27℃，濕度60%，通風(fēng)10次/h，自由飲食飲水。

1.2腦卒中大鼠模型的建立 從48只雄性大鼠中隨機(jī)選取12只為正常組，剩余36只參考文獻(xiàn)〔7〕建立腦卒中模型，大鼠腹腔注射5% 0.1 g/kg氯胺酮進(jìn)行麻醉處理，將大鼠仰臥位放置在手術(shù)臺上，頸部備皮、消毒，在頸部正中切開暴露出左頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，然后分離出頸外動脈、夾閉頸總動脈，盡量不刺激迷走神經(jīng)，自頸外動脈逆行穿刺插管后注入1 ml/kg栓子鹽水混懸液，立刻結(jié)扎頸外動脈，開放頸總動脈夾，血液會將栓子沖入頸內(nèi)動脈，即腦卒中模型建立成功。

1.3干預(yù)分組 將36只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、對照組、RTN1-C干預(yù)組，各12只，模型組、對照組給予等體積的生理鹽水干預(yù)，對照組將5 μl的慢病毒以0.5 μl/min的速率注射到大鼠右側(cè)側(cè)腦室中，針頭固定5 min，為無意義序列，RTN1-C干預(yù)組與對照組方法一樣，注射5 μl的慢病毒,其引物序列為5′-CACCGGAGCTTGATCACCCTTTCTTCAAGA GAGAAAGGGTGATATCAAGCTCCTTTTTTG-3′,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參蛋白，其上下游引物為5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′,5′-TGGTGAAG-ACGCCAGTAGATT-3′。所有大鼠連續(xù)干預(yù)3 w。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、四肢抓握能力、協(xié)調(diào)能力檢測 建模后12 d采用Morris水迷宮檢測大鼠的認(rèn)知功能，Morris水迷宮是一個直徑為160 cm、深50 cm的圓形水池，將東、西、南、北4個方向的水池劃分為T1、T2、T3、T4 4個象限，在每個象限的池壁中間分別設(shè)置一個特殊的標(biāo)記，以供大鼠記憶，向水池內(nèi)注水、加入無毒的黑色色素，使平臺隱匿，讓各組大鼠在水池內(nèi)游泳，用攝像機(jī)跟蹤大鼠游泳過程，使用專門的計算機(jī)軟件完成數(shù)據(jù)采集和圖像分析，然后進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，過程為將大鼠放置在水池中，讓其在水池內(nèi)游泳，將大鼠找到隱匿平臺的時間稱為潛伏期，每只大鼠限時60 s尋找平臺，若不能找到平臺，則潛伏期為60 s。潛伏期越短，表明大鼠的認(rèn)知功能越強(qiáng)。建模2 d后采用網(wǎng)屏測試實(shí)驗(yàn)檢測大鼠四肢抓握能力，自制40 cm×30 cm的不銹鋼網(wǎng)袋，網(wǎng)眼為2 cm×2 cm，將網(wǎng)屏放置在離地面20 cm的位置，將大鼠放置在上面，然后將網(wǎng)屏旋轉(zhuǎn)為垂直狀態(tài)并保持5 s，觀察大鼠是否能夠從網(wǎng)屏上跌落下來，評估標(biāo)準(zhǔn)、總分為3分，0分為大鼠的前爪能夠握住網(wǎng)屏，且堅(jiān)持5 s，不會跌落，1分為大鼠能夠暫時抓住網(wǎng)屏，下滑一段距離但不會跌落，2分為大鼠在5 s內(nèi)跌落，3分為網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動時大鼠便跌落。建模7 d后采用疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測試大鼠的協(xié)調(diào)能力，使用ZB-200疲勞轉(zhuǎn)棒儀(成都泰盟軟件有限公司)檢測大鼠的協(xié)調(diào)能力，大鼠的初始轉(zhuǎn)速為10 r/min，5 min后將速度提升至40 r/min，保持5 min，使用計算機(jī)軟件記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒上行走的時間，大鼠在轉(zhuǎn)棒上行走的時間越長，表明大鼠的協(xié)調(diào)能力越強(qiáng)。

1.5超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平檢測 在大鼠隱靜脈處進(jìn)行采血，待大鼠固定后，將后腿外側(cè)區(qū)域剃毛后暴露采血點(diǎn)，將采血針刺入采血點(diǎn)，采集1 ml血液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測SOD、MDA、ROS水平，先用包被緩沖液將SOD、MDA、ROS稀釋至最合適的濃度，在37℃下儲存4 h，用洗滌液洗滌3次，每次4 min，加入含有抗原的標(biāo)本，在特異抗體和抗原結(jié)合下形成抗體復(fù)合物，再次洗滌后，固相載體上只剩下特定抗體，加入酶標(biāo)記特異性抗體與復(fù)合物中的抗體結(jié)合，使抗體被酶標(biāo)記，洗滌后，載體上的酶量表示特定抗體的量，添加底物來顯現(xiàn)顏色，通過顏色深度來分析SOD、MDA、ROS的水平。

1.6病理學(xué)觀察 腹腔注射10% 0.35 ml/100 kg，將大鼠放置在冰塊上，迅速斷頭處死取腦，為方便切片，將大鼠的腦組織放置在冰盒上，在-25℃下速凍20 min，然后用刀片去除大鼠腦組織的嗅球和小腦部分，從腦前極開始進(jìn)行冠狀切片，片厚2 mm，將切好的腦片浸入預(yù)熱的三苯基四氮唑溶液中進(jìn)行染色，每孔一片，在37℃的烘箱中避光孵育25 min，10 min后將腦片翻面，保證兩面均染色，正常腦組織為紅色，腦梗死組織為白色。

1.7血腦屏障通透性、腦梗死率、腦血流灌流量、大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目檢測 斷頭處死后，稱取200 mg的腦梗死組織離心，取上清液，在酶標(biāo)儀630 nm處測定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠的血腦屏障通透性。采用Image圖像處理軟件，計算腦梗死率=梗死區(qū)總面積/全腦總面積×100%。將取出的腦組織放置在4%多聚甲醛中，在4℃下遮光保存48 h，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激光波長為488 nm，20×，z軸方向每0.5 μm掃一層，共掃100個層面，將所獲得的圖像進(jìn)行三維重建，綠色熒光所占體積為血漿容量，腦血流灌注量=掃描區(qū)血漿容量/掃描區(qū)總?cè)萘俊?00%。在每張腦組織切面梗死的區(qū)域選取2個固定視野進(jìn)行拍照，用Imagepro Plus軟件分析圖像，計算每組200倍視野內(nèi)大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目。

1.8Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白檢測 Western印跡法檢測Nogo-A、RhoA、ROCK2、環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)，將取出的腦組織超聲粉碎，加入1 ml的RIPA裂解液和10 μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)，取上清液加入蛋白上樣緩沖液，在100℃下變性15 min，然后將樣品進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個孔中加入40 μg的總蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜時間為60 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，然后加入Nogo-A、RhoA、ROCK2的一抗抗體，在4℃下過夜，第2天取出后在37℃下放置60 min，TBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在37℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，然后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)暗室曝光，利用Image J軟件掃描條帶灰度值，計算Nogo-A、RhoA、ROCK2的量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RTN1-C對腦卒中模型大鼠潛伏期、四肢抓握能力評分、行走時間的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預(yù)組潛伏期顯著延長，四肢抓握能力評分顯著升高，行走時間顯著縮短(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預(yù)組潛伏期顯著縮短，四肢抓握能力評分顯著降低，行走時間顯著延長(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預(yù)組潛伏期顯著縮短，四肢抓握能力評分顯著降低，行走時間顯著延長(均P<0.05)。見表1。

組別潛伏期(s)四肢抓握能力評分(分)行走時間(min)血腦屏障通透性(μg/g)腦梗死率(%)腦血流灌流量(%)大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目(個)正常組9.73±1.640.50±0.03171.42±2.5925.94±2.520.00±0.0029.53±2.8670.54±3.19模型組39.54±2.431)2.99±0.011)42.15±2.611)281.83±6.101)26.42±1.591)8.53±0.761)10.68±1.621)對照組33.99±1.511)2)2.43±0.021)2)94.00±2.791)2)157.69±5.041)2)22.56±0.081)2)19.00±1.411)2)16.98±2.231)2)RTN1-C干預(yù)組26.49±3.101)2)3)2.14±0.281)2)3)102.04±5.661)2)3)102.89±2.831)2)3)18.40±2.161)2)3)20.19±2.471)2)3)46.46±2.271)2)3)F/P值393.414/0.001687.715/0.0012 540.314/0.0017 200.710/0.001914.391/0.001209.600/0.0011 608.205/0.001

2.2RTN1-C對腦卒中模型血腦屏障通透性、腦梗死率、腦血流灌流量、大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預(yù)組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著升高，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預(yù)組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著降低，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目顯著升高(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預(yù)組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著降低，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經(jīng)元數(shù)目顯著升高(均P<0.05)。見表1。

2.3各組病理學(xué)觀察 正常組腦組織無明顯病理改變，神經(jīng)細(xì)胞排列緊密且整齊；模型組腦組織周圍出現(xiàn)明顯的水腫和壞死，細(xì)胞排列不規(guī)則、疏松、細(xì)胞間隙大、呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、神經(jīng)細(xì)胞變形壞死、有大量的炎性細(xì)胞浸潤；對照組腦組織腫脹減輕，無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、固縮細(xì)胞減少；RTN1-C干預(yù)組腦組織腫脹減輕、神經(jīng)元水腫變性減少，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，細(xì)胞周圍的間隙減少。見圖1。

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(三苯基四氮唑染色，×200)

2.4RTN1-C對腦卒中模型大鼠SOD、MDA、ROS水平的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預(yù)組SOD水平顯著降低，MDA、ROS水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預(yù)組SOD水平顯著升高，MDA、ROS水平顯著降低(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預(yù)組SOD水平顯著升高，MDA、ROS水平顯著降低(均P<0.05)。見表2。

2.5RTN1-C對腦卒中模型大鼠Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預(yù)組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，對照組與RTN1-C干預(yù)組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著降低(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預(yù)組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著降低(均P<0.05)。見表2和圖2。

圖2 Western印跡法分析各組Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中是由局部腦組織缺血、腦組織水腫、乳酸累積、代謝紊亂等原因引起的，可導(dǎo)致嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，對患者的生活質(zhì)量造成了極大的影響〔8，9〕。

RTN1家族共有RTN1-A、RTN1-B、RTN1-C 3個剪接體，RTN1-C主要在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中表達(dá)，RTN1-C在腦卒中患者中表達(dá)下調(diào)可減輕腦組織損傷程度〔10，11〕。研究表明〔12〕，抑制RTN1-C表達(dá)可減輕腦卒中患者腦組織的損傷程度，并可恢復(fù)缺血再灌注中部分受損的神經(jīng)功能，因此，RTN1-C可能為治療腦卒中的一個靶點(diǎn)。本研究表明，RTN1-C可增強(qiáng)腦卒中模型大鼠的認(rèn)知功能、四肢抓握能力和協(xié)調(diào)能力。

血腦屏障是腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障及血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障可阻止機(jī)體中有害的物質(zhì)通過血液進(jìn)入到腦組織〔13〕，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理狀態(tài)具有重要的意義〔14，15〕。腦梗死率是梗死區(qū)總面積與全腦總面積的比例，腦血流量是單位時間內(nèi)血液通過腦血管某橫截面積的流量。本研究提示RTN1-C可有效降低大鼠的血腦屏障通透性、腦梗死率，提高腦血流灌流量，增加大腦皮層完整神經(jīng)元的數(shù)目。

SOD具有催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫、維持機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化平衡的作用，是參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因子，SOD水平越低表明機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng)烈〔16，17〕。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)氧化終極產(chǎn)物，其含量越高表明機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)氧化反應(yīng)越強(qiáng)烈，對機(jī)體損害越嚴(yán)重。ROS是機(jī)體內(nèi)吞噬細(xì)胞發(fā)揮其吞噬作用和殺傷作用的重要介質(zhì)，當(dāng)ROS水平失去平衡時，就會對機(jī)體造成損傷〔18〕。本研究顯示，RTN1-C干預(yù)可有效緩解腦卒中大鼠腦損傷，表明其作用機(jī)制可能是通過改善腦梗死大鼠體內(nèi)SOD、MDA、ROS水平，抑制腦卒中大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

Nogo-A在抑制神經(jīng)細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散、阻止軸突再生和腦卒中后軸突重建方面具有重要作用〔19〕。RhoA是Rho蛋白家族的成員之一，活化的RhoA可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成，進(jìn)而導(dǎo)致軸突的回縮和生長錐的塌陷。有研究表明〔20〕，可通過抑制RhoA蛋白的過度活化，改善腦卒中大鼠的認(rèn)知功能和記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)突軸的重塑。ROCK2可通過磷酸化肌球蛋白輕鏈，使突觸前和突觸后的細(xì)胞骨架蛋白解聚，進(jìn)而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突生長，促進(jìn)突觸的重塑，高水平的Nogo-A、RhoA、ROCK2在腦卒中大鼠中可限制軸突的生長和神經(jīng)的可塑性〔21〕。本研究結(jié)果顯示，RTN1-C干預(yù)可通過調(diào)控Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白水平來改善大鼠的認(rèn)知功能和記憶能力。

綜上，RTN1-C干預(yù)通過調(diào)控Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白、SOD、MDA、ROS水平，可改善腦卒中大鼠的認(rèn)知功能、抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而提高大鼠四肢抓握能力和協(xié)調(diào)能力，降低大鼠的血腦屏障通透性、腦梗死率，提高腦血流灌流量，增加大腦皮層完整神經(jīng)元的數(shù)目。