褪黑素通過(guò)抑制程序性細(xì)胞壞死對(duì)心肌缺血再灌注的保護(hù)作用

楊吉平 費(fèi)琳 柴學(xué)軍 祁存芳,3

(1西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神心理科；3青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室)

缺血再灌注損傷(IRI)常引起患者出現(xiàn)多種并發(fā)癥，甚至死亡，是心肌缺血臨床治療效果不佳的主要原因，應(yīng)用外源性藥物預(yù)防和治療是防止心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷的重要策略，但是由于藥品的篩選、來(lái)源和副作用等問(wèn)題，至今仍然未獲得效果滿意的藥物和干預(yù)方法〔1〕。因此，探尋人體內(nèi)源性具有抗心肌缺血損傷的物質(zhì)成為目前心肌保護(hù)方面的研究熱點(diǎn)之一。褪黑素(MLT)是由松果體產(chǎn)生的一種吲哚類激素，近年研究發(fā)現(xiàn)，它不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物節(jié)律有調(diào)控作用，而且對(duì)心血管系統(tǒng)在生理和病理?xiàng)l件下也具有調(diào)節(jié)作用〔2〕，還對(duì)腦、心、肝和腎等器官的缺血損傷有明顯的保護(hù)作用〔3～6〕，因此，MLT已經(jīng)成為近年保護(hù)心肌損傷領(lǐng)域的一個(gè)很有潛力的藥物。但是MLT抗心肌 IRI的機(jī)制尚未完全闡明，成為限制其進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用的瓶頸。為此，本研究從程序性細(xì)胞壞死分子機(jī)制的角度出發(fā)，觀察MLT對(duì)大鼠心肌IRI的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar雄性大鼠40 只，220～250 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分4組，每組10只。模型組給予建立心肌IRI模型，給藥組是在IRI模型的基礎(chǔ)上在缺血前30 min及缺血后30 min，分2次腹腔注射MLT溶液，MLT低、高劑量組分別按1 mg/kg 和5 mg/kg 給予。假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎。

1.2試劑及儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染料和肌酸激酶(CK)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京 Solarbio 生物公司，Western印跡電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自 Bio-Rad 公司。兔抗RIPK3 抗體購(gòu)自 Abcam 公司，磷酸化人混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(MLKL)抗體購(gòu)自 Milipore 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自武漢三鷹生物公司。MLT購(gòu)自 Sigma 公司，使用前將MLT 5 mg 加 0.1 ml 二甲基亞砜溶解后，再用生理鹽水定容至 1 ml，4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3心肌IRI模型的建立 將大鼠用2%戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定，行氣管插管后接人工呼吸機(jī)，呼吸頻率調(diào)為 55 次/min，潮氣量約 25 ml/kg，四肢連接心電圖機(jī)。胸骨左側(cè)縱行切口，于第 3 肋間隙分離肋間肌，進(jìn)入縱隔，剪開心包膜，暴露心臟，以左冠狀靜脈為定位點(diǎn)，于左心耳根部下方約 2 mm 處進(jìn)針，從肺動(dòng)脈圓錐旁出針，用 5 號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn) S-T 段明顯抬高或 T 波高聳，心尖變白作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，缺血 50 min 后松開線結(jié)再灌注 3 h，即為大鼠心肌IRI模型建立。

1.4心肌梗死面積測(cè)定和蘇木素-伊紅(HE)染色 取新鮮大鼠心臟于-80℃冷凍50 min后，以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的部位為分界，從心尖處開始橫切，基本垂直于心臟縱軸方向，每個(gè)心臟共切6片，片厚約1 mm，然后置于37℃，避光，1%TTC染液中，染色20 min，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后再用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，用Image J軟件測(cè)量每組的梗死面積。各組另取1只大鼠麻醉后，用0.1 mol/L PBS徹底沖出循環(huán)內(nèi)的血液，用4%多聚甲醛進(jìn)行灌流固定，取出心臟后用4%多聚甲醛4℃后固定12 h，然后石蠟包埋，切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，對(duì)比觀察各組心肌細(xì)胞和心肌結(jié)構(gòu)的改變情況。

1.5血清CK活性的測(cè)定 大鼠IRI手術(shù)結(jié)束后，經(jīng)左心室取全血1 ml，分離出血清，按 CK 活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 340 nm 處測(cè)定每組血清的吸光度 A 值。在 37℃，pH7.0 條件下，1 ml 血清每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol NADPH 為一個(gè) CK 酶的活性單位。CK 活性值(U/ml)的計(jì)算按產(chǎn)品說(shuō)明書給出的公式。

1.6Western印跡檢測(cè) 大鼠處死后，開胸暴露心臟，在冰上快速取出各組大鼠左心室前壁心肌組織少許，置于 1.5 ml EP 管中，每管加入 RIPA(pH 7.4)200 μl，超聲裂解 20 min，4℃，12 000 r/min，離心 15～20 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè) EP 管中，BCA 法蛋白定量后上樣，每孔15 μl,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h后 TBST 漂洗 3 次，然后分別加入 RIPK3(1∶200)、pMLKL(1∶500)和 GAPDH(1∶3 000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗 3 次，加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST 漂洗 4 次后 ECL發(fā)光，對(duì)各組蛋白表達(dá)的條帶灰度對(duì)比分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MLT對(duì)心肌梗死面積的影響 將大鼠的心肌組織切片行 1% TTC染色后，心肌未梗死區(qū)域呈紅色，梗死區(qū)域呈現(xiàn)蒼白色，結(jié)果顯示，心肌梗死區(qū)與左冠狀動(dòng)脈前支供血區(qū)域基本吻合，提示造模成功。模型組大鼠心肌梗死面積明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。MLT低劑量干預(yù)后，有降低梗死面積的趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯(P>0.05)；MLT高劑量則顯著減小缺血再灌注所致的梗死面積(P<0.01)。模型組血清 CK活性較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)。MLT干預(yù)后，血清CK活性較模型組明顯降低(P<0.05)，且隨著MLT濃度的升高，CK活性的下降更加顯著(P<0.01)，見表1。

表1 MLT對(duì)IRI的梗死面積和CK活性的影響

模型組心肌纖維明顯紊亂，呈波浪狀彎曲，或皺縮，甚至溶解，細(xì)胞間可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，心肌肌質(zhì)凝固、伊紅染色增強(qiáng)。MLT低劑量干預(yù)后，有改善病變的趨勢(shì)，但仍然可見凝固性收縮帶，橫紋不清或消失，心肌纖維粗大。MLT高劑量能明顯抑制心肌結(jié)構(gòu)的上述病理變化，心肌壞死灶明顯好轉(zhuǎn)，仍可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)等。見圖1。

圖1 心肌缺血再灌注損傷后的心肌組織結(jié)構(gòu)變化(HE染色，×400)

2.2MLT可抑制心肌IRI后程序性壞死關(guān)鍵蛋白的表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織中幾乎不表達(dá) RIPK3 和 磷酸化MLKL蛋白，而當(dāng)發(fā)生IRI后，如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌損傷區(qū)的 RIPK3 和磷酸化 MLKL 蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，MLT低劑量組大鼠心肌損傷RIPK3 和磷酸化 MLKL蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而MLT高劑量組可使這兩種蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見表2。

1～4：假手術(shù)組、模型組、MLT低劑量組、MLT高劑量組圖2 MLT對(duì)大鼠心肌IRI后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表達(dá)的影響

表2 MLT 對(duì)大鼠心肌 IRI 后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

冠狀動(dòng)脈病變所致的缺血性心臟病事件逐年升高，再灌注治療仍然是目前臨床上治療缺血性心血管疾病最有效的手段，主要通過(guò)藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)使冠狀動(dòng)脈再通重新恢復(fù)血供。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，一方面可以使缺血心肌恢復(fù)血液供應(yīng)，另一方面會(huì)形成新的損傷，即IRI〔7〕。目前關(guān)于心肌IRI的研究主要集中在能量代謝障礙致氧自由基增多，細(xì)胞內(nèi)鈣超載和繼發(fā)性炎癥反應(yīng)等方面，但具體損傷機(jī)制仍不十分清楚〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，由 RIPK1/RIPK3/MLKL 介導(dǎo)的程序性壞死在心肌 IRI 中發(fā)揮著重要作用，應(yīng)用 Necrostatin(Nec)-1能顯著減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心、腦、腎和視網(wǎng)膜等器官的缺血性損傷〔9～11〕，因此，程序性壞死抑制劑有希望成為抗IRI的靶點(diǎn)藥物。RIPK3、MLKL的募集和磷酸化是程序性壞死信號(hào)通路中最重要的兩種蛋白質(zhì)，本研究結(jié)果表明IRI可誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。

MLT生理狀態(tài)下，體內(nèi)含量極小，一般在pmol/L水平。MLT的生物學(xué)功能主要有清除氧自由基抗衰老，調(diào)節(jié)生物鐘促進(jìn)睡眠，調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等方面，常常作為保健性的膳食補(bǔ)充劑被廣泛應(yīng)用。隨年齡的增長(zhǎng)，松果體的鈣化不斷增加，60歲時(shí)松果體的鈣化率為64%～69%，故老年人的血漿MLT水平更低，然而老年人冠狀動(dòng)脈供血不足常?；疾÷屎芨咔覈?yán)重〔12〕。有研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后心肌 IRI 的程度與患者血漿中MLT的水平呈負(fù)相關(guān)，MLT的含量越高，心肌 IRI 的程度就越輕〔13〕。已知心肌缺血再灌注時(shí)程序性壞死顯著增強(qiáng)，MLT保護(hù)缺血再灌注誘發(fā)的心肌損傷作用是否與其抑制程序性壞死有關(guān)是本研究的切入點(diǎn)。本研究結(jié)果表明高劑量MLT能保護(hù)心肌細(xì)胞的IRI。MLT可通過(guò)抑制程序性細(xì)胞壞死從而發(fā)揮IRI的保護(hù)作用。綜上，MLT為人體的一種內(nèi)源性物質(zhì)，幾乎無(wú)不良反應(yīng)，倘若能進(jìn)一步應(yīng)用于缺血再灌注性疾病的治療當(dāng)中，將可能給更多的患者帶來(lái)好處。