mTOR、Beclin1和LC3在非黑色素瘤性皮膚腫瘤中的表達

魏姍姍 嚴卿文 閆璐 邱賢文 賴寬 肖莎 米向斌

(南方醫(yī)科大學 1珠江醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510280;2陽春市婦幼保健院皮膚科；3南方醫(yī)院皮膚科；4珠江醫(yī)院病理科)

皮膚鱗狀細胞癌(SCC)、基底細胞癌(BCC)和脂溢性角化(SK)統(tǒng)稱為非黑色素瘤性皮膚腫瘤(NMSC)，是起源于表皮或皮膚附屬器的腫瘤〔1〕，發(fā)展速度較緩慢，絕大部分僅出現(xiàn)局部破壞性病變。SCC和BCC的治療方法多樣，包括手術、物理、藥物和放射治療等，但仍有一定的局限性，比如復發(fā)率、手術切除后形成的瘢痕或畸形影響美觀〔2〕。SK是臨床最常見的皮膚良性腫瘤，病因不明，與紫外線照射及日光性損傷密切相關。SCC、BCC和SK三者均好發(fā)于中老年人，病理均表現(xiàn)為上皮細胞增生異常。皮膚腫瘤的形成機制與其他腫瘤類似，可能與腫瘤細胞增殖、細胞凋亡、血管生成及細胞黏附等密切相關。隨著人口老齡化和檢測手段的進展，全球NMSC的發(fā)病率每年增加3%～8%〔3〕，針對其發(fā)病機制的研究變得尤為重要。

自噬是真核生物特有的溶酶體介導的分解代謝過程，分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和微自噬三種。目前巨自噬研究較清楚，也是本文重點研究的對象，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)/Beclin1通路、三磷酸肌醇(IP3)和細胞內Ca2+都可以調控巨自噬的活性〔4〕。Ki-67是一種核蛋白質，由Mki-67基因編碼，是細胞增殖的重要標志物，常可作為預測惡性腫瘤發(fā)展及預后的指標。自噬與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，有望成為腫瘤治療的新方向。然而自噬在皮膚腫瘤中的研究較少，本文擬初步探討mTOR、Beclin1和微管相關蛋白輕鏈(LC)3在NMSC中的表達及意義。

1 材料及方法

1.1一般資料 SK組、BCC組和SCC組標本各27例，來自2017年1月至2019年1月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院就診的患者，病例均行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化確診，臨床及病理資料完整。正常對照(Normal)組15例，取自皮膚科活檢手術切除的部分正常皮膚。各組年齡及性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組年齡和性別分布比較

1.2主要試劑 兔源mTOR、LC3、Beclin1抗體均購自美國 Abcam公司。免疫組化試劑盒〔封閉液、二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑〕 購自武漢博士德生物有限公司。

1.3免疫組化及結果判定 SK、BCC、SCC組織白片來自醫(yī)院病理科，正常皮膚組織石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片。全部切片常規(guī)脫蠟入水，修復抗原，3%H2O2除去內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗(mTOR、Beclin1、LC3)過夜。第2天依次室溫孵育二抗、DAB顯色，蘇木素復染，最后脫水透明后烘干封片。由至少兩名病理科診斷醫(yī)師對免疫組織化學染色切片進行評估。在顯微鏡下觀察SCC、BCC和SK細胞和正常表皮著色情況，積分數(shù)=陽性染色細胞百分比評分×染色強度評分。陽性染色細胞百分比判定標準：每個標本都隨機選擇5個高倍視野(×200)，每個高倍視野計數(shù)100個細胞，計算出每個視野中陽性細胞比的平均數(shù)。<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強度判定標準：無著色或呈與背景均勻一致的淡黃色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性等級：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為陽性(++)；9～12為強陽性(+++)。

Ki-67免疫組化由兩位病理科醫(yī)師單獨判讀后取平均。Ki-67陽性標準：細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒染色。先在5倍鏡下隨機選取病損區(qū)域結構良好、背景清晰的5個區(qū)域，隨后隨機觀察5個200倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算出陽性細胞的所占比例即為Ki-67的百分比。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prim 7.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各組mTOR的表達 mTOR在SK、BCC和SCC組中的表達均高于Normal組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mTOR在SCC組中的表達顯著高于BCC組(P<0.05)；mTOR在BCC組中的表達顯著高于SK組(P<0.05)。見表2。mTOR在正常皮膚標本中絕大多數(shù)呈弱陽性表達(圖1)。

圖1 各組中mTOR的表達

2.2各組Beclin1的表達 自噬相關基因Beclin1在正常皮膚標本中絕大多數(shù)呈陽性或強陽性表達(圖2)。Beclin1在BCC和SCC組中表達均顯著低于Normal組(P<0.05)，在SK組中的表達低于Normal組，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Beclin1在SK組中的表達顯著高于BCC組(P<0.05)；Beclin1在BCC組中的表達顯著高于SCC組(P<0.05)。見表2。

圖2 各組中Beclin1的表達

2.3各組中LC3的表達 LC3在正常皮膚標本中絕大多數(shù)呈陽性或強陽性表達(圖3)。LC3在SK、BCC和SCC組中表達均顯著低于Normal組(P<0.05)；LC3在SK組中的表達顯著高于BCC組(P<0.05) ；LC3在BCC組中的表達顯著高于SCC組(P<0.05)。見表2。

圖3 各組中LC3的表達

表2 各組mTOR、Beclin1、LC3的相對表達比較

2.4各指標間相關性分析 mTOR相對表達值與Beclin1、LC3表達值呈負相關(r=-0.486、-0.381，均P<0.01)，Beclin1相對表達值與LC3呈正相關(r=0.884,P<0.01)。

2.5Ki-67在BCC和SCC中的百分率 Ki-67在BCC、SCC組中陽性表達率分別為27.00%±12%、37.48%±10%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

自噬是一種高度保守的細胞內成分降解過程，具有維持細胞結構和功能穩(wěn)定的重要作用。在不同的疾病狀態(tài)下，細胞自噬具有不同的作用，比如清除損傷作用的細胞因子、直接誘導損傷細胞死亡、甚至可能降解正常細胞結構〔5〕。自噬相關基因啟動子、調節(jié)轉錄因子，蛋白激酶等多種因子的激活都可以調控細胞自噬的活性。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/VPS30的同源基因，在自噬的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要作用。此外，Beclin1是自噬體形成的一個必需因子，它可介導其他自噬蛋白定位于自噬而調控自噬體的形成與成熟。酶母Atg8基因(在哺乳動物中的同系物是LC3)家族蛋白是細胞自噬形成過程中重要的適配器蛋白，與細胞自噬過程中的許多關鍵步驟相關，比如自噬體的形成、成熟等。

mTOR是細胞內一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于雷帕霉素的作用靶點，是細胞生長、新陳代謝、衰老的中心控制器。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復合體。mTORC1可通過磷酸化核糖體S6激酶調控蛋白質的合成，或通過真核起始因子4E結合蛋白1促進轉錄而對細胞生長、新陳代謝等產生影響〔6〕。mTOR信號通路存在于各種細胞中，參與細胞生長、增殖和分化調節(jié)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。既往的研究表明mTORC1通路在基底細胞癌中高表達，而且針對mTOR的靶向藥物對進展期基底細胞癌有治療作用〔7,8〕。Zeng等〔9〕研究顯示咖啡酸正丁酯可通過抑制絲氨酸-蘇氨酶激酶(Akt)/mTOR從而引起皮膚癌細胞株(A431細胞)的凋亡。此外，Akt/mTOR的抑制劑LY3023414在皮膚癌細胞株(A431細胞)的體內、體外研究顯示:在皮膚癌中Akt/mTOR通路被異常激活，而LY3023414可以抑制皮膚癌Akt/mTOR的激活和癌細胞的生長〔10〕。本研究結果顯示，mTOR在SCC、BCC和SK中表達均高于正常皮膚組織，與相關研究〔7～10〕結論相似。

自噬是維持細胞存活、分化和生長所必須的溶酶體降解途徑，與多種腫瘤細胞的惡性轉化和細胞生長密切相關。mTOR通路與巨自噬密切相關，可通過以下途徑調控巨自噬的活性：①在營養(yǎng)豐富的條件下，mTOR可通過直接磷酸化和Unc-51樣自噬激酶(ULK)1蛋白去穩(wěn)定化而對ULK1負性調節(jié)；②當營養(yǎng)物質下降時，mTOR失活，此時ULK1可磷酸化AMBRA1和芐氯素(BECN)1，進而激活VPS34，最終導致來自內質網(ER)的自噬體的成熟，啟動自噬；③下降的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)Ⅰ(Ⅰ級PI3K)/Akt可間接失活mTOR而誘發(fā)巨自噬〔11〕；④mTOR通路可通過抑癌基因，比如p53、人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)和結節(jié)硬化(TSC)2等，調控自噬的活性〔12〕。既往的研究表明，在肝細胞癌中mTOR通路被異常激活而導致細胞凋亡和自噬抑制〔13〕。在銀屑病中，不同蛋白相互作用可通過激活mTORC1而抑制自噬的活性從而促進銀屑病的發(fā)生和發(fā)展〔14〕。在皮膚癌中關于自噬機制的研究鮮為少見。Thongrakard等〔15〕研究表明皮膚癌細胞株(A431細胞)的巨自噬活性較正常組下降。本研究發(fā)現(xiàn)SCC、BCC和SK中自噬活性指標Beclin 1、LC3表達下降，mTOR異常增高；且LC3與Beclin 1的表達呈正相關，LC3與mTOR表達呈負相關。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是評價腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標之一。與BCC相比，SCC組織中Ki-67高表達，提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發(fā)生轉移，預后較差，與臨床表現(xiàn)一致。在SCC組織中Ki-67和mTOR均高表達，提示兩者可能共同促進腫瘤的發(fā)生，且兩者表達越高可能預示腫瘤惡性程度更高、侵襲力更強，易發(fā)生轉移，有希望成為判斷SCC預后的有力指標。

綜上所述，NMSC的發(fā)病可能與mTOR/Beclin 1/LC3信號通路密切相關，而且mTOR與NMSC的惡性程度呈正相關，同時自噬與NMSC的惡性程度呈負相關性。因此，降低mTOR從而調控自噬的活性，可能對NMSC發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。