小麥B-box基因家族全基因組鑒定與表達(dá)分析

王艷朋 凌 磊 張文睿 王 丹 郭長虹

小麥B-box基因家族全基因組鑒定與表達(dá)分析

王艷朋 凌 磊 張文睿 王 丹 郭長虹*

哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/ 黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江哈爾濱 150025

B-box (BBX)是一類含有1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白, 在植物生長發(fā)育中起著重要作用。本研究明確小麥B-box轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量、基因結(jié)構(gòu)和分類進(jìn)化關(guān)系, 研究各基因成員在不同組織中的特異性表達(dá)以及對非生物脅迫的響應(yīng)。從小麥全基因組中鑒定得到87個(gè)B-box基因家族成員, 所有TaBBXs蛋白均含有B-box結(jié)構(gòu)域。TaBBXs編碼146～489個(gè)氨基酸, 理論等電點(diǎn)為4.32～10.42。染色體定位分析表明, TaBBXs分布在除1A、1B和1D之外的18條小麥染色體上。通過系統(tǒng)發(fā)育分析將TaBBXs劃分為5個(gè)亞家族, 有0～4個(gè)內(nèi)含子。在同組內(nèi)同一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹分支中的亞族成員具有高度相似的基因結(jié)構(gòu)。qRT-PCR分析的20個(gè)TaBBXs基因, 具有不同的組織表達(dá)模式, 16個(gè)基因在葉中有較高表達(dá),和僅在葉中有較高表達(dá), 而在穗中表達(dá),在根中特異性表達(dá)。在不同逆境脅迫下, TaBBXs呈現(xiàn)不同表達(dá)模式, 11個(gè)基因在低溫脅迫后上調(diào)表達(dá), 12個(gè)基因在ABA處理后下調(diào)表達(dá), 鹽脅迫后10個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá), 干旱脅迫后7個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),、、和基因在2種或2種以上脅迫下有顯著的上調(diào)表達(dá)。

小麥; 全基因組; B-box基因家族; 非生物脅迫; 基因表達(dá)

小麥(L.)是世界上最重要的糧食作物之一, 占谷物種植面積的30%[1-2]。其基因組十分復(fù)雜, 由A、B、D 3個(gè)亞基因組整合而形成的異源六倍體(AABBDD), 重復(fù)序列高達(dá)85%, 大小約為15 GB[3-4]。小麥在生長發(fā)育過程中面臨多種環(huán)境脅迫, 其中鹽、干旱、低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。植物B-box蛋白可參與逆境響應(yīng), 但目前尚未對小麥B-box基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析。因此, 本研究基于小麥全基因組對B-box基因家族進(jìn)行分析, 為進(jìn)一步研究該基因家族成員功能提供參考, 研究結(jié)果對進(jìn)一步培育或改良小麥抗性品種具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TF)能夠調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育, 在植物對高鹽、干旱和高溫等逆境的響應(yīng)及應(yīng)答過程中具有重要作用[6]。B-box轉(zhuǎn)錄因子家族是一個(gè)具有B-box結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白家族。1995年首次在擬南芥()的一個(gè)晚花突變體中鑒定得到B-box基因, 命名為(), 并證實(shí)了該基因參與植物開花和其他生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)[7]。隨后的研究進(jìn)一步揭示, 植物B-box轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)[8]、開花[9]、避蔭反應(yīng)[10]、生物或非生物應(yīng)激反應(yīng)[11]、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。如可以通過誘導(dǎo)ABI5抑制種子萌發(fā)[13],能促進(jìn)UV-B輻射下的光形態(tài)發(fā)生, 增強(qiáng)對高劑量UV-B輻射的耐受性[14]。Gangappa等[15]指出, AtBBX25通過與HY5形成二聚體并抑制其功能, 參與植物光形態(tài)發(fā)生的負(fù)調(diào)控。最新研究表明, 蘋果中的MdBBX37能夠和MdMYB1和MdMYB9相互作用, 抑制這兩種蛋白與目標(biāo)基因的結(jié)合, 從而對花青素生物合成產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[16]。非生物脅迫方面,(最初被稱為)參與鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 可以使鹽敏感型的突變體酵母具有更強(qiáng)的耐鹽能力[17-18]。通過ABA途徑參與脅迫響應(yīng), 在受到外源的ABA、鹽和滲透脅迫時(shí), 該基因上調(diào)表達(dá)[19]。的下調(diào)表達(dá)可以使植物的耐熱性增加, 過表達(dá)該基因可以降低植物的耐熱性[11]。能夠增強(qiáng)擬南芥的耐鹽耐旱性, 在大腸桿菌()中表達(dá)的MdBBXs分別增強(qiáng)了細(xì)胞對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[20-21]。梨啟動(dòng)子顯著響應(yīng)ABA、光、低溫、滲透以及鹽脅迫處理[22]。

目前B-box基因家族的研究主要集中在模式植物擬南芥、水稻和蒺藜苜蓿中, 而在小麥中尚未見報(bào)道。隨著小麥基因組的公布[4], 使得對小麥B-box基因家族分析成為可能。通過生物信息學(xué)方法對全基因組中小麥B-box基因家族成員進(jìn)行鑒定, 對所有家族成員的理化信息、結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)模式進(jìn)行分析。利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析20個(gè)B-box基因在不同組織中以及非生物脅迫條件下的表達(dá)模式, 為解析B-box基因家族在小麥中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

植物試驗(yàn)材料為小麥中國春(L., Chinese Spring), 將小麥種子表面用15%次氯酸鈉消毒5 min, 蒸餾水沖洗3次, 消毒后的種子置于無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)24 h, 將幼芽移栽至小麥水培盒中, 種植在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中, 在22℃光照16 h的溫室中生長。將2周齡小麥幼苗分別用0.2 mol L?1NaCl、20% PEG、100 μmol L?1ABA和4℃進(jìn)行脅迫處理, 以正常條件下的幼苗為對照。處理6 h后對處理組和對照組植株進(jìn)行取材, 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。此外, 采集在4月至7月大田中培養(yǎng)的小麥組織: 根、莖、葉、穗(開花前1 d)和籽粒(授粉后10 d)進(jìn)行組織表達(dá)分析, 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。將所有樣品液氮速凍后, –80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小麥B-box基因家族成員的鑒定

小麥全基因組數(shù)據(jù)、蛋白序列和注釋文件從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中下載, 擬南芥和水稻B-box基因序列和蛋白序列下載自NCBI (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)。已知的擬南芥[23]、水稻[24]B-box蛋白序列為參考對小麥的蛋白序列進(jìn)行本地Blast, 設(shè)置-value參數(shù)為0.001, 得到候選的小麥B-box蛋白序列。去重復(fù)之后提交到SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/)和NCBI的在線工具CDD (Conserved Domain Database)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測, 以確定其含有B-box所特有的B-box保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 小麥B-box蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

利用ExPASy網(wǎng)站(http://expasy.org/)對小麥B-box氨基酸序列進(jìn)行等電點(diǎn)、分子量預(yù)測等理化性質(zhì)分析。根據(jù)CDD所提供的家族成員所含結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)整理結(jié)構(gòu)域氨基酸序列, 再采用weblogo (http://weblogo.berkeley.edu/)對結(jié)構(gòu)域保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行可視化顯示。

1.4 小麥B-box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用ClustalX軟件對小麥B-box氨基酸序列進(jìn)行多序列比對, 通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹: 采用鄰接法(Neighbor-Joining algorithm), 泊松校正(Poission correction), 成對刪除(pairwise deletion), Bootstrap重復(fù)值1000次。參考擬南芥和水稻B-box基因家族的亞族分類結(jié)果對小麥B-box基因家族進(jìn)行亞族分類。

1.5 小麥B-box基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

從小麥基因信息GFF3文件中提取TaBBXs的染色體位置和基因結(jié)構(gòu)信息, 分別使用MapDraw和GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具將TaBBXs的染色體定位信息和基因結(jié)構(gòu)信息(外顯子、內(nèi)含子等)進(jìn)行可視化顯示。

1.6 小麥B-box基因家族的復(fù)制事件及同源性分析

使用BLASTp、OrthoMCL、多重共線掃描工具包(MCScanX)和默認(rèn)參數(shù)分析基因復(fù)制事件(<1e–5), 如果2個(gè)同源基因被5個(gè)或更少的基因分開, 則它們被鑒定為串聯(lián)重復(fù), 如果2個(gè)基因被5個(gè)以上的基因分開或分布在不同的染色體上, 則稱為片段重復(fù)。同源基因結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步鑒定, 鑒定標(biāo)準(zhǔn)為: 同源序列覆蓋率>75%, 同源性>75%。

1.7 小麥B-box基因家族的啟動(dòng)子分析

從小麥全基因組數(shù)據(jù)庫中提取每個(gè)小麥B-box基因啟動(dòng)子區(qū)域(上游2000 bp), Plant CARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)分析順式作用元件(-acting element)的種類、數(shù)目及功能。

1.8 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取小麥總RNA, 將提取出的總RNA作為模板, 利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047, TaKaKa)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用軟件Primer 3和Primer Premier 6設(shè)計(jì)引物, 具體引物序列見表1, 其中小麥為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系為cDNA 2 μL, 2×SYBR Premix Ex10 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, 正、反向引物各0.8 μL和ddH2O 6 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 30 s; 94℃ 5 s, 54℃ 15 s, 72℃ 31 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 并使用2–ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,< 0.05表示差異顯著,< 0.01表示差異極顯著。

表1 本試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥基因組中B-box家族基因鑒定

參考基因, 共獲得87個(gè)小麥B-box基因家族成員, 根據(jù)它們在染色體上的相對位置將其命名為。預(yù)測結(jié)果顯示, 大多數(shù)TaBBXs蛋白的等電點(diǎn)都小于7, 只有、、、、和七個(gè)成員在7以上; TaBBXs基因的長度有很大差距, 從441 bp ()到1473 () bp, 分子量從15,371.44 Da ()到52,005.04 () Da (附表1)。

2.2 小麥B-box基因家族蛋白序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

TaBBXs蛋白的分子長度在146～490個(gè)氨基酸不等。在87個(gè)TaBBXs中, 23個(gè)TaBBXs包含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)保守的CCT結(jié)構(gòu)域。29個(gè)成員包含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 但沒有CCT結(jié)構(gòu)域。9個(gè)TaBBXs只包含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域, 剩下的26個(gè)包含1個(gè)B-box域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域(附表1)。蛋白質(zhì)序列比對顯示, TaBBXs的B-box1和B-box2結(jié)構(gòu)域具有相似的保守序列, TaBBXs蛋白質(zhì)中的CCT結(jié)構(gòu)域是高度保守的(圖1)。此外, 特定位點(diǎn)的氨基酸殘基高度保守, 暗示其保守的功能, 例如1、4、13、21和24位點(diǎn)的半胱氨酸殘基在B-box結(jié)構(gòu)域中高度保守。

為了詳細(xì)研究TaBBXs成員的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和功能差異, 對87個(gè)TaBBXs蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 包括AtBBXs和OsBBXs系統(tǒng)發(fā)育樹(附圖1)。根據(jù)Khanna等[23]的分組研究和分析, 將TaBBXs進(jìn)一步劃分為5個(gè)亞家族(圖2), 5個(gè)亞家族成員數(shù)量分別為23、9、21、28、6。亞家族I、II和III的成員是同時(shí)包含B-box結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域的TaBBXs。亞家族I成員包含1～2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域, 亞家族II成員包含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域, 亞家族III成員包含1～2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和0～1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。小麥有兩類在擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)的B-box基因, 亞族I成員中有一類, 它包含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域(、、、和); 另一類是亞族III成員, 其中大多數(shù)成員具有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域, 但、、、和擁有B-box2結(jié)構(gòu)域, 這與包含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域的其他成員分組不同。第IV組和第V組的成員沒有CCT結(jié)構(gòu)域, 分別有2個(gè)和1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域。

2.3 小麥B-box基因家族的染色體定位與基因復(fù)制

小麥B-box基因不均等地分布在小麥21條染色體中的18條上, 1A、1B、1D染色體上沒有發(fā)現(xiàn)B-box基因, 其中的1個(gè)成員()無法進(jìn)一步定位到染色體(圖3)。在7A染色體上分布的基因最多, 共含有9個(gè)基因; 其次是6A、6B、6D和7D染色體上分別含有8個(gè)基因; 其余染色體上均含有1～7個(gè)基因不等。有92% (80/87)的小麥B-box成員顯示出重復(fù)事件, 在122個(gè)復(fù)制事件中并未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)事件, 在不同的染色體中發(fā)現(xiàn)了高度相似的基因, 出現(xiàn)了片段重復(fù)事件。如圖3所示, 重復(fù)事件主要發(fā)生在染色體6A、6B和6D上, 而3A、3B和3D上則較少。此外, 我們對同源基因進(jìn)行進(jìn)一步聚類分析發(fā)現(xiàn), 所有同源基因都處于同一進(jìn)化分支中(附圖2), 除、、和基因外, 在3個(gè)部分同源染色體組(A、B、D)上都有同源位點(diǎn), 如:和為同源基因位于同一進(jìn)化分支中, 且分別位于2A、2B和2D染色體上, 表明小麥B-box基因具有大量的同源位點(diǎn), 同源保留率高。

2.4 小麥B-box基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

小麥B-box家族成員的外顯子數(shù)目為1～5個(gè), 內(nèi)含子數(shù)目為0～4個(gè)(圖4)。對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), I組的大多數(shù)成員具有1個(gè)內(nèi)含子; II組中、和不含內(nèi)含子, 其余基因含1個(gè)內(nèi)含子; III組和IV組的成員結(jié)構(gòu)較相似, 含1～4個(gè)內(nèi)含子; V組中的基因結(jié)構(gòu)較簡單, 所有成員都不含內(nèi)含子。

圖3 小麥B-box基因家族成員在染色體上的位置和基因復(fù)制

Fig. 3 Chromosome location and gene duplications of the B-box gene family in wheat

每個(gè)彩色條代表一條染色體, 基因命名是根據(jù)它們在染色體上的位置來標(biāo)記的, 片段復(fù)制基因用彩色線條連接。

Each colored bar represents a chromosome, gene names are labeled on the basis of their positions on the chromosomes, segmental duplication genes are linked by colored lines.

2.5 小麥B-box基因家族的啟動(dòng)子分析

從TaBBXs中鑒定出101種順式作用元件, 其中40種在大多數(shù)成員中被檢測出來。除了2種傳統(tǒng)的啟動(dòng)子元件(TATA-box, CAAT-box)外, 其余38個(gè)順式作用元件可分為4組: 14個(gè)具有光響應(yīng)性, 包括MRE、G-Box、ACE、AE-box、Sp1、GT1-motif、GATA-motif、TCCC-motif、I-box、TCT-motif、GA-motif、Box I、Box 4和ATCT-motif; 8個(gè)是激素反應(yīng)性的, 包括CGTCA-motif、TGACG-motif、ABRE、P-box、ERE、GARE-motif、AuxRR-core和TGA-element; 9個(gè)是脅迫響應(yīng)元件: ARE、MBS、LTR、W box、GC-motif、CCAAT-box、TCA-element、WUN-motif和TC-rich repeats。第4組為其他順式作用元件, 如: 胚乳表達(dá)所需的順式作用元件(GCN4_motif), 與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件(CAT-box)等。下表展示了與脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的元件(表2)。

2.6 小麥B-box基因家族在不同組織和非生物脅迫及激素處理下的表達(dá)

采用qRT-PCR分析了20個(gè)小麥B-box基因在不同組織和干旱、低溫、鹽和ABA處理下的表達(dá)模式(圖5)。20個(gè)基因在所有檢測組織中均有不同程度的表達(dá),在所有組織中均有表達(dá), 大多數(shù)(16個(gè))基因在葉中有較高的表達(dá), 其次是在穗、根和莖中表達(dá), 而較少在籽粒中表達(dá)。和在葉中有較高表達(dá),在穗中特異性表達(dá),在根中特異性表達(dá),和在穗和根中表達(dá)量較高。

表2 預(yù)測小麥B-box家族基因啟動(dòng)子中順式調(diào)控元件

TaBBXs響應(yīng)非生物脅迫, 但表達(dá)水平不同(圖6)。在干旱脅迫下,、、、、和顯著上調(diào)表達(dá); 大多數(shù)基因在低溫脅迫下上調(diào)表達(dá),、、、和等11個(gè)基因的表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào); 在鹽脅迫處理下, 基因出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá), 其中和等10個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá); 在ABA處理下, 除和外, 所有小麥B-box基因成員的表達(dá)水平都很低;、、和在2種或2種以上脅迫下相比對照有顯著的上調(diào)表達(dá)。

3 討論

B-box基因家族是鋅指轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)家族, 包含B-box和CCT結(jié)構(gòu)域[23,25]。目前, B-box基因家族已經(jīng)在多個(gè)物種中被鑒定出來, 比如在擬南芥[23]、水稻[24]、番茄[26]、馬鈴薯[27]、蘋果[28-29]、梨[30]、葡萄[31]分別鑒定出32、30、29、30、64、37、24個(gè)B-box家族成員。本研究從小麥全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了87個(gè)B-box基因成員, 均高于上述物種中的成員數(shù), 可能是因?yàn)樾←準(zhǔn)钱愒戳扼w, 具有3個(gè)部分同源基因組, 存在更多的同源基因(homoeologs), 高同源保留率也可以部分解釋小麥B-box基因數(shù)量多的原因。

根據(jù)B-box結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和序列特征以及CCT結(jié)構(gòu)域的存在特征, B-box在擬南芥中被分為5組, I組和II組中的所有成員都包含2個(gè)B-box和CCT結(jié)構(gòu)域, 第III組具有1個(gè)B-box和CCT結(jié)構(gòu)域, 第IV組和V組分別具有2個(gè)和1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域[23]。在小麥中同樣被分為5組, 有1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域的53個(gè)TaBBXs被分為I組、II組和III組, 具有2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域的28個(gè)成員為IV組, V組6個(gè)成員含有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域。但其中III組中有4個(gè)TaBBXs (、和)不具有CCT結(jié)構(gòu)域, 這與擬南芥分組不一致, 在其他物種中也發(fā)現(xiàn)了類似的不一致, 例如, 水稻中的和屬于第I組, 玉米中的屬于第II組, 盡管它們都缺少1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域[25,32]。番茄中的、和以及水稻中的和屬于第III組, 盡管它們有2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域[25-26]?？赡苁沁M(jìn)化缺失或重復(fù)導(dǎo)致了分組的差異, 與之前在水稻研究中的分類相似[25]。

基因結(jié)構(gòu)的多樣性在基因家族的進(jìn)化中也起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示, 小麥B-box基因在同組內(nèi)同一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹分支中的亞族成員具有高度相似的基因結(jié)構(gòu), 總體內(nèi)含子數(shù)目較少, 顯示出進(jìn)化的保守性。V組中的一些同源基因, 如和顯示了一個(gè)保守的基因結(jié)構(gòu), 與同組成員有所差異。這種差異可能不是偶然的突變事件, 而是植物B-box轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化的一種保守模式[33]。此外, 保守序列分析發(fā)現(xiàn), B-box1與B-box2相比具有更高的保守性, CCT結(jié)構(gòu)域是高度保守的[32]。前人報(bào)道中, 有一種理論認(rèn)為, 最初僅有的B-box2結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中發(fā)生復(fù)制事件隨后又發(fā)生刪除事件, 導(dǎo)致出現(xiàn)B-box結(jié)構(gòu)域數(shù)目不同的B-box基因[32]。本研究中B-box1比B-box2具有更高的保守性, 所以可能是B-box2中發(fā)生了刪除事件并產(chǎn)生B-box1, 與Crocco和Botto提出的進(jìn)化模型一致[32]。

復(fù)制事件對植物進(jìn)化過程中基因家族成員的擴(kuò)增至關(guān)重要[34]。植物中的基因復(fù)制主要有片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制[35-36]。在本研究中, 沒有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制事件只發(fā)生了片段復(fù)制事件。表明片段復(fù)制事件可能是小麥B-box基因家族成員擴(kuò)增的主要原因, 這與玉米、水稻等物種相類似[37]。

A: 對照; B: 20% PEG處理6 h; C: 4℃處理6 h; D: 0.2 mol L?1NaCl處理6 h; E: 100 μmol L?1ABA處理6 h。*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

A: control; B: six hours of 20% PEG treatment; C: six hours of 4℃ treatment; D: six hours of 0.2 mol L?1NaCl treatment; E: six hours of 100 μmol L?1ABA treatment. * and ** indicate significantly different at< 0.05 and< 0.01, respectively.

基因表達(dá)模式可以提供相關(guān)基因功能的重要信息。在擬南芥中, B-box基因(,)的過表達(dá)促進(jìn)開花[38], 而過表達(dá)()則延遲開花[39], 在小麥中與處于同一組的基因有、、、、和, 其中、和基因在低溫脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)。小麥開花主要受春化影響, 即小麥開花需經(jīng)過長時(shí)間環(huán)境低溫誘導(dǎo)的生理過程, 同時(shí)在和啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了參與低溫響應(yīng)的順式作用元件LTR (表2), 因此和基因可能參與了小麥開花調(diào)控過程。在玉米中, B-box同源基因參與不同的生物學(xué)過程, 在基因表達(dá)上具有明顯的組織特異性[40]; B-box基因家族成員在番茄各組織中均有不同程度的表達(dá)[26], 馬鈴薯B-box家族成員在不同器官中表達(dá)模式不同[27]。小麥B-box基因在不同組織中有不同的表達(dá)模式,、等16個(gè)基因在葉中有較高的表達(dá),、、和在穗、根等組織中表達(dá)量較高, 說明小麥B-box基因在植物生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用, 在不同發(fā)育階段可能具有獨(dú)特的功能。

非生物脅迫, 如鹽、干旱、極端溫度, 都會(huì)對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn), 在B-box基因啟動(dòng)子區(qū)存在脅迫反應(yīng)順式作用元件, 如ARE、LTR、MBS和TC-rich, 與干旱、鹽和低溫有關(guān)。79個(gè)B-box基因都至少具有1個(gè)脅迫響應(yīng)順式作用元件, 表明它們在逆境反應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用。在鹽、低溫、干旱脅迫和ABA處理下, 小麥B-box家族成員均有不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)。之前的研究結(jié)果表明, 耐鹽蛋白AtBBX24在擬南芥的高鹽度條件下促進(jìn)根的生長, 耐鹽活性也在酵母細(xì)胞中觸發(fā)[17], 小麥、、、和與處于同一分組內(nèi), 這些基因受到鹽脅迫誘導(dǎo), 因此、、、和可能參與了鹽脅迫調(diào)控。菊花能夠提高植物的耐寒性或耐旱性[43],在擬南芥中過表達(dá), 可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對干旱脅迫的抗性[44], 小麥、、、、和與處于同一分組內(nèi), 干旱脅迫顯著誘導(dǎo)、、和的表達(dá), 并且在和基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)含有響應(yīng)干旱脅迫的順式作用元件MBS (表2), 表明和在干旱脅迫過程中可能起著重要的作用。我們還發(fā)現(xiàn),和在鹽、低溫和干旱脅迫下都上調(diào)表達(dá), 表明這2個(gè)基因可能整合了不同的非生物脅迫信號。、和等11個(gè)基因在鹽、低溫和干旱脅迫下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式, 說明這些基因可能在小麥響應(yīng)不同的非生物脅迫過程中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究對小麥B-box基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定, 共篩選獲得87個(gè)TaBBXs家族成員, 可分為5組。除了1A、1B和1D號染色體外, 其他的18條小麥染色體上均有TaBBXs分布, TaBBXs內(nèi)含子數(shù)目0～4個(gè)。小麥B-box基因家族表達(dá)具有組織特異性, TaBBXs不同程度地響應(yīng)鹽、干旱和低溫脅迫, 推測TaBBXs可能參與調(diào)控小麥的鹽、干旱和低溫等逆境響應(yīng)過程。

附表和附圖 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical- zuowxb.aspx。

[1] 解松峰, 吉萬全, 張耀元, 張俊杰, 胡衛(wèi)國, 李俊, 王長有, 張宏, 陳春環(huán). 小麥重要產(chǎn)量性狀的主基因+多基因混合遺傳分析. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46: 365–384. Xie S F, Ji W Q, Zhang Y Y, Zhang J J, Hu W G, Li J, Wang C Y, Zhang H, Chen C H. Genetic effects of important yield traits analyzed by mixture model of major gene plus polygene in wheat.,2020, 46: 365–384 (in Chinese with English abstract).

[2] 劉登才, 張連全, 郝明, 黃林, 甯順腙, 袁中偉, 姜博, 顏澤洪, 伍碧華, 鄭有良. 小麥族的基因組顯性及其育種學(xué)意義. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46: 1465–1473. Liu D C, Zhang L Q, Hao M, Huang L, Ning S Z, Yuan Z W, Jiang B, Yan Z H, Wu B H, Zheng Y L. Genome dominance and the breeding significance in Triticeae., 2020, 46: 1465–1473 (in Chinese with English abstract).

[3] Choulet F, Alberti A, Theil S, Glover N, Barbe V, Daron J, Pingault L, Sourdille P, Couloux A, Paux E, Leroy P, Mangenot S, Guilhot N, Le Gouis J, Balfourier F, Alaux m, Jamilloux V, Poulain J, Durand C, Bellec A, Gaspin C, Safar J, Dolezel J, Rogers J, Vandepoele K, Aury J M, Mayer K, Berges H, Quesneville H, Wincker P, Feuillet C. Structural and functional partitioning of bread wheat chromosome 3B., 2014, 345: 1249721.

[4] IWGSC. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome., 2018, 361: eaar7191.

[5] 茹京娜, 于太飛, 陳雋, 陳明, 周永斌, 馬有志, 徐兆師, 閔東紅. 小麥鋅指轉(zhuǎn)錄因子對低溫的響應(yīng)及其互作蛋白的篩選. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50: 2411–2422.Ru J N, Yu T F, Chen J, Chen M, Zhou Y B, Ma Y Z, Xu Z S, Min D H. Response of wheat Zinc-Finger transcription factorto cold and its screening of interacting proteins., 2017, 50: 2411–2422 (in Chinese with English abstract).

[6] Klug A, Schwabe J W. Protein motifs 5. Zinc fingers., 1995, 9: 597–604.

[7] Putterill J, Robson F, Lee K, Simon R, Coupland G. Thegene ofpromotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors., 1995, 80: 847.

[8] Chang C S, Maloof J N, Wu S H. COP1-mediated degradation of/optimizes seedling development in., 2011, 156: 228?239.

[9] Gonzalezschain N D, Diazmendoza M, Zurczak M, Suarezlopez P. Potatois involved in photoperiodic tuberization in a graft-transmissible manner., 2012, 70: 678–690.

[10] Crocco C D, Holm M, Yanovsky M J, Botto J F. Function of B-box under shade., 2011, 6: 101–104.

[11] Wang Q, Tu X, Zhang J, Chen X, Rao L. Heat stress-inducednegatively regulates the thermotolerance in., 2013, 40: 2679–2688.

[12] Fan X Y, Sun Y, Cao D M, Bai M Y, Luo X M, Yang H J, Wei C Q, Zhu S W, Sun Y, Chong K., a B-box protein, promotes photomorphogenesis downstream of both Brassinosteroid and light signaling pathways., 2012, 5: 591–600.

[13] Bai M J, Sun J J, Liu J Y, Ren H R, Wang K, Wang Y L, Wang C Q, Dehesh K. The B-box protein BBX19 suppresses seed germinationinduction of ABI5., 2019, 99: 1192–1202.

[14] Yadav A, Lingwan M, Yadukrishnan P, Masakapalli S K, Datta S.promotes hypocotyl growth, primary root elongation and UV-B tolerance in., 2019, 14: e1588672.

[15] Gangappa S N, Crocco C D, Johansson H, Datta S, Hettiarachchi C, Holm M, Botto J F. TheB-box protein BBX25interacts with HY5, negatively regulatingexpression to suppress seedling photomorphogenesis., 2013, 25: 1243–1257.

[16] An J P, Wang X F, Espley R V, Lin W K, Bi S Q, You C X, Hao Y J. An apple B-box protein MdBBX37 modulates anthocyanin biosynthesis and hypocotyl elongation synergistically with MdMYBs and MdHY5., 2020, 61: 130–143.

[17] Lippuner V, Cyert M S, Gasser C S. Two classes of plant cDNA clones differentially complement yeast calcineurin mutants and increase salt tolerance of wild-type yeast., 1996, 271: 12859–12866.

[18] Nagaoka S, Takano T. Salt tolerance-related protein STObinds to a MYB transcription factor homologue and confers salt tolerance in., 2003, 54: 2231–2237.

[19] Min J H, Chung J S, Lee K H, Kim C S. Thetranscription factor,, positively regulates abiotic stress tolerance through an abscisic acid-dependent manner in., 2015, 57: 313–324.

[20] Liu X, Li R, Dai Y Q, Yuan L, Sun Q H, Zhang S Z, Wang X Y. A B-box zinc finger protein, MdBBX10, enhanced salt and drought stresses tolerance in., 2019, 99: 437–447.

[21] Liu X, Dai Y Q, Li R, Yuan L, Chen X S, Wang X Y. Members of B-box protein family fromenhanced abiotic stresses tolerance in, 2019, 61: 421–426.

[22] 王日紅, 宋敏燕, 王然, 楊英杰. 山梨B-box基因表達(dá)特性及其在童期調(diào)控中的功能分析. 園藝學(xué)報(bào), 2019, 46: 1458–1472. Wang R H, Song M Y, Wang R, Yang Y J. Expression characteristics of B-box geneand its function in juvenile regulation., 2019, 46: 1458–1472 (in Chinese with English abstract).

[23] Khanna R, Wu S H. Thes B-box zinc finger family., 2009, 21: 3416.

[24] Huang J Y, Zhao X B, Weng X Y, Wang L, Xie W B. The rice B-box zinc finger gene family: genomic identification, characterization, expression profiling and diurnal analysis., 2012, 7: e48242.

[25] Gangappa S N, Botto J F. The BBX family of plant transcription factors., 2014, 19: 460–470.

[26] Chu Z, Wang X, Li Y, Yu H, Li J, Lu Y, Li H, Ouyang B. Genomic organization, phylogenetic and expression analysis of the B-box gene family in tomato., 2016, 7: 1552.

[27] Talar U, Kie?bowicz-Matuk A, Czarnecka J, Rorat T. Genome- wide survey of B-box proteins in potato ()—Identification, characterization and expression patterns during diurnal cycle, etiolation and de-etiolation., 2017, 12: e0177471.

[28] Shalmani A, Fan S, Jia P, Li G, Muhammad I, Li Y, Sharif R, Dong F, Zuo X, Li K. Genome identification of B-box gene family members in seven rosacea species and their expression analysis in response to flower induction in., 2018, 23: 1763.

[29] Liu X , Li R , Dai Y Q, Chen X S, Wang X Y. Genome-wide identification and expression analysis of the B-box gene family in the apple (Borkh.) genome., 2017, 293: 1–13.

[30] Cao Y, Han Y, Meng D, Li D, Jiao C, Jin Q, Lin Y, Cai Y. B-box genes: genome-wide identification, evolution and their contribution to pollen growth in pear (Rehd.)., 2017, 17: 156.

[31] Wei H R, Wang P P, Chen J Q, Li C J, Wang Y Z, Yuan Y B, Fang J G, Leng X P. Genome-wide identification and analysis of B-box gene family in grapevine reveal its potential functions in berry development., 2020, 20: 72.

[32] Crocco C D, Botto J F. BBX proteins in green plants: insights into their evolution, structure, feature and functional diversification., 2013, 531: 44?52.

[33] Zou Z Y, Wang R H, Wang R, Yang S L, Yang Y J. Genome-wide identification, phylogenetic analysis, and expression profiling of the BBX family genes in pear., 2017, 93: 37–50.

[34] Magadum S, Banerjee U, Murugan P, Gangapur D, Ravikesavan R. Gene duplication as a major force in evolution., 2013, 92: 155–161.

[35] Cannon S B, Mitra A, Baumgarten A, Young N D, May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in., 2004, 4: 10.

[36] Moore R C, Purugganan M D. The early stages of duplicate gene evolution., 2003, 100: 15682–15687.

[37] Abdullah S, Jing X Q, Shi Y, Izhar M, Zhou M R, Wei X Y, Chen Q Q, Li W Q, Liu W T, Chen K M. Characterization of B-box gene family and their expression profiles under hormonal, abiotic and metal stresses inplant., 2019, 20: 27.

[38] Hassidim M, Harir Y, Yakir E, Kron I, Green R M. Over- expression ofcan induce flowering in short-day grown., 2009, 230: 481–491.

[39] Cheng X F, Wang Z Y. Overexpression of, agene, delays flowering by reducing expression of CO and FT in., 2005, 43: 758–768.

[40] Li W, Wang J, Sun Q, Li W, Yu Y, Zhao M, Meng Z. Expression analysis of genes encoding double B-box zinc finger proteins in maize., 2017, 17: 653–666.

[41] Rengasamy P. World salinization with emphasis on Australia., 2006, 57: 1017–1023.

[42] Cramer G R, Urano K, Delrot S, Pezzotti M, Shinozaki K. Effects of abiotic stress on plants: a systems biology perspective., 2011, 11: 163.

[43] Yang Y, Ma C, Xu Y, Wei Q, Imtiaz M, Lan H, Gao S, Cheng L, Wang M, Fei Z. A zinc finger protein regulates flowering time and abiotic stress tolerance in chrysanthemum by modulating gibberellin biosynthesis., 2014, 26: 2038–2354.

[44] 劉焱, 邢立靜, 李俊華, 戴紹軍. 水稻含有B-box鋅指結(jié)構(gòu)域的OsBBX25蛋白參與植物對非生物脅迫的響應(yīng). 植物學(xué)報(bào), 2012, 47: 366–378. Liu Y, Xing L J, Li J H, Dai S J. Rice B-box zinc finger protein OsBBX25 is involved in the abiotic response., 2012, 47: 366–378 (in Chinese with English abstract).

Genome-wide identification and expression analysis of B-box gene family in wheat

WANG Yan-Peng, LING Lei, ZHANG Wen-Rui, WANG Dan, and GUO Chang-Hong*

Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province / College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025, Heilongjiang, China

B-box (BBX) is a class of zinc finger proteins that contain one or two B-box domains and play important roles in plant growth and development. The number, gene structure and phylogenetic relationship of wheat B-box transcription factors, as well as their expression specificity in different tissues and response to abiotic stress were investigated. A total of 87 members of B-box gene family were identified from wheat genome and all contained the B-box domain. TaBBXs encoded 146 to 489 amino acids and the isoelectric points ranged from 4.32 to 10.42. Chromosome mapping showed that these genes were distributed on 18 wheat chromosomes except 1A, 1B, and 1D. Based on phylogenetic analysis, TaBBXs were divided into five subfamilies, with 0–4 introns. The members of the subfamily in the same phylogenetic tree branch in the same group had highly similar gene structures. The qRT-PCR revealed that the investigated 20 genes had different expression patterns, and most genes were highly expressed in leaves, andandwere only highly expressed in leaves, whilewas expressed in spikes,was specifically expressed in roots. These genes showed different expression patterns under different stress. 11 genes were up-regulated after low temperature stress, 13 genes were down-regulated after ABA treatment, 10 genes were up-regulated after salt stress, and 7 genes were down-regulated after drought stress.,,,,andwere significantly up-regulated under two or more stresses.

wheat; genome-wide; B-box gene family; abiotic stress; gene expression

10.3724/SP.J.1006.2021.01077

本研究由國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)前期研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB111500)和哈爾濱師范大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(HSDSSCX2020-08)資助。

This study was supported by the Preliminary Research Project of the National Basic Research Program of China (973 Program) (2011CB111500) and the Graduate innovation fund of Harbin Normal University (HSDSSCX2020-08).

郭長虹, E-mail: kaku3008@126.com

E-mail: 13694609045@163.com

2020-09-18;

2021-01-13;

2021-02-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210222.0940.002.html