大麥籽粒發(fā)育進(jìn)程中7種黃酮類化合物的積累特性分析

賀軍與 鐘 偉 陳云瓊 王衛(wèi)斌 熊靜蕾 蔣亞麗 施輝蒙 陳升位

研究簡報

大麥籽粒發(fā)育進(jìn)程中7種黃酮類化合物的積累特性分析

賀軍與 鐘 偉 陳云瓊 王衛(wèi)斌 熊靜蕾 蔣亞麗 施輝蒙 陳升位*

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 云南昆明 650201

解析大麥籽粒中黃酮類化合物的積累特性有利于其含量檢測、積累機制和生理功能研究。本文采用高效液相色譜測定了8個大麥材料籽粒、7個發(fā)育時期15種黃酮類化合物的含量。在7個時期, 15種化合物總含量呈上升—下降的變化趨勢, 在花后10 d最高(335.71± 41.63) μg g?1, 成熟籽粒最低(165.52±38.63) μg g?1?；ê?0 d曲克蘆丁、芹菜素、短柄花素和白楊素的含量最高, 分別為(155.75±30.76) μg g?1、(8.41±1.54) μg g?1、(10.71±1.53) μg g?1和(4.41±0.60) μg g?1; 花后5 d柚皮素查爾酮、花后15 d二氫槲皮素和花后25 d木犀草素的含量最高, 分別為(42.41±15.39) μg g?1、(17.92±6.60) μg g?1和(5.19±1.37) μg g?1。其中, 柚皮素查爾酮的含量變化趨勢為下降—平臺—下降; 曲克蘆丁和白楊素的含量變化趨勢為上升—下將—平臺—下降; 二氫槲皮素、木犀草素、芹菜素和芒柄花素的含量變化趨勢為上升—下降。在含量檢測等研究中, 大麥籽粒曲克蘆丁、芹菜素、短柄花素和白楊素的適宜取樣時間均為花后10 d, 柚皮素查爾酮、二氫槲皮素和木犀草素的適宜取樣時間分別為花后5、15和25 d。上述結(jié)果為大麥籽粒黃酮類化合物含量測定等研究提供了理論支持。

大麥籽粒; 發(fā)育時期; 黃酮類化合物; 積累特性

黃酮類化合物是植物特有的次生代謝產(chǎn)物[1], 具有抗氧化、抗過敏和預(yù)防心血管疾病等功效[2]。該類化合物由植物苯丙烷代謝途徑合成, 經(jīng)甲基化、乙?；吞腔刃揎椇笮纬刹煌男揎棶a(chǎn)物, 并儲存于植物細(xì)胞液泡中[1,3]。但不同物種、不同器官(或組織)及其發(fā)育進(jìn)程均可影響黃酮類化合物的積累特性[4-7]。大麥?zhǔn)撬幨惩粗参? 其黃酮類化合物及其含量已備受關(guān)注[1]。到目前為止, 已構(gòu)建并完善了大麥黃酮化合物提取、純化和鑒定的技術(shù)體系[8], 并鑒定了大麥葉片、莖和籽粒等組織(或器官)中山奈酚、槲皮素和楊梅素等10多種黃酮類化合物, 測定了所鑒定化合物的含量[2,8-15]。已有報道表明, 大麥基因型可有效影響其葉片、莖和籽粒等組織(或器官)中黃酮類化合物的含量[16-20]。但對大麥籽粒中曲克蘆丁、二氫槲皮素和木犀草素等7種黃酮類化合物的含量及其積累特性缺乏報道。本研究采用高效液相色譜測定了7個發(fā)育時期, 籽粒顏色不同的8個大麥品種(或品系)籽粒中15種黃酮類化合物的含量, 分析了不同時期15個化合物的總含量及特定化合物在不同發(fā)育時期的含量差異, 解析了7種化合物在籽粒發(fā)育進(jìn)程中的積累特性, 以期為大麥籽粒中7種黃酮類化合物的含量檢測、及其積累機制和生理功能等研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料均為遺傳穩(wěn)定的品種或品系, 其中3個為地方品種、其余為育成品種(或品系), 見表1。所有材料由課題組繁育并保存。

表1 試驗材料及其基本特性

1.2 試驗方法

1.2.1 材料繁殖 試驗材料均種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆明市盤龍區(qū)教學(xué)試驗農(nóng)場, 播種期為2018年11月9日。隨機排列, 每個品系種植6行, 每行20株, 行距20 cm, 株距5 cm, 重復(fù)3次。其他管理措施與常規(guī)大田生產(chǎn)一致。

1.2.2 黃酮類化合物提取與純化 自開花后5 d起, 間隔5 d取1次籽粒, 直至花后30 d, 完熟期取成熟籽粒。將收取的不同處理的籽粒用錫箔紙包裹后置于牛皮紙袋, 于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩２捎肔GJ-12C真空冷凍機干燥籽粒, 將干燥的籽粒碾磨至粉末狀(AM600研磨儀、研磨5 min)。等量混合3個重復(fù)的籽粒粉末, 構(gòu)建不同材料的樣品池。每個樣品池稱取2.0 g粉末溶于20.0 mL、70%的甲醇溶液, 采用YQ-1001A超聲波清洗儀處理浸提液30 min, 取上清液。采用0.22 μm的微孔濾膜過濾提取物。

1.2.3 高效液相色譜檢測 色譜柱: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 μm×4.6 mm×150 mm)。流動相: A相為0.1%的冰醋酸, B相為乙腈, 洗脫梯度: 0 min A∶B為95∶5 (v/v), 60.0 min為95∶5 (v/v), 60.1 min為95∶5 (v/v), 65.0 min為95∶5 (v/v); 流速0.8 mL min?1; 柱溫30℃; 進(jìn)樣量10 μL; 檢測波長: 280 nm。重復(fù)試驗3次。

1.2.4 高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)品制作 將二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等15種標(biāo)準(zhǔn)品溶入70%甲醇, 分別配制100 mg L?1的母液, 置于4℃暗儲存?zhèn)溆?。基于母液分別配制1、2、4、8、16、32、64和128 μg mL?1的工作液和15種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合工作液。按1.2.3部分的高效液相色譜條件分別檢測不同濃度條件下15種標(biāo)準(zhǔn)品的滯留時間和色譜峰?；赟PSS 20.0軟件中回歸模塊默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度的回歸方程(相關(guān)系數(shù)≥0.99)。

1.2.5 黃酮類化合物及其含量差異分析 利用標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度的回歸方程計算樣品濃度, 并將其轉(zhuǎn)換為含量?；赟PSS 20.0軟件中方差和多重比較模塊分析7個時期各化合物的含量差異, 顯著和極顯著水平分別為0.05和0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 15種化合物總含量的差異分析

本試驗測定了7個發(fā)育時期、8個材料籽粒的二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等15種黃酮類化合物的含量, 作者發(fā)現(xiàn)15種化合物的總含量自花后5 d上升、花后10 d最高, 然后逐漸下降、到成熟籽粒達(dá)到最低(圖1)。但獨立樣本測驗結(jié)果表明, 僅有花后10 d與花后30 d (=2.71、=14, 0.05≥≥0.017)和成熟籽粒(=3.00、=14, 0.05≥≥0.01), 花后15 d與成熟籽粒(=2.25、=14, 0.05≥≥0.41)的總含量差異達(dá)到了顯著水平。

T1~T7: 花后5、10、15、20、25、30 d和成熟籽粒。

T1?T7: on the 5th, 10th, 15th, 20th, 25th, 30th day after anthesis, and at mature stage, respectively.

2.2 不同發(fā)育時期化合物含量的差異分析

雖然15種化合物總量在籽粒發(fā)育的7個時期存在差異, 但只有曲克蘆丁、二氫槲皮素和木犀草素等7種化合物的含量達(dá)到了顯著或極顯著水平。多重比較結(jié)果表明, 花后10 d與花后15 d曲克蘆丁含量間沒有顯著差異, 但顯著或極顯著高于其他5個時期的含量(表2)。花后10 d與花后15、20和25 d二氫槲皮素的含量間均沒有差異, 但顯著或極顯著高于花后5 d、30 d和成熟籽粒的含量(表2)。花后20 d與花后25 d、花后30 d和成熟籽粒4個時期木犀草素的含量間均沒有顯著差異, 但顯著或極顯著高于其他3個時期的含量(表2)?；ê? d柚皮素查爾酮的含量極顯著或顯著高于其他6個時期的含量(表2)?；ê?、10、15和20 d 4個時期的芹菜素含量間和短柄花素含量間均沒有顯著差異, 但極顯著或顯著高于其他3個時期的含量(表2)。花后15 d白楊素的含量顯著或極顯著高于其他6個時期的含量(表2)。

2.3 籽粒發(fā)育期間化合物的積累規(guī)律分析

本研究分析了籽粒發(fā)育進(jìn)程中7種化合物的含量變化趨勢, 結(jié)果顯示可將7種化合物的積累模式分為3類。第1類為下降—平臺—下降趨勢, 平臺期為花后15~30 d, 涉及化合物為柚皮素查爾酮; 第2類為上升—下將—平臺—下降趨勢, 平臺期出現(xiàn)在花后20~30 d, 涉及化合物包括曲克蘆丁和白楊素; 第3類為上升—下降趨勢, 涉及化合物為二氫槲皮素、木犀草素、芹菜素和芒柄花素(圖2)。柚皮素查爾酮的含量峰值出現(xiàn)在花后5 d、二氫槲皮素的含量峰值出現(xiàn)在花后15 d, 木犀草素的含量峰值出現(xiàn)在花后25 d, 其余4種化合物的峰值均出現(xiàn)在花后10 d (圖2)。

3 討論

雖然已報道了大麥籽粒中槲皮素、楊梅素和山奈酚及其含量[2,8,9-22], 但少有二氫槲皮素、木犀草素和柚皮素等其余12種化合物及其含量的報道。通過高效液相色譜, 本文鑒定了二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等15種化合物, 并測定了7個發(fā)育時期大麥籽粒中各化合物的含量。在8個大麥材料成熟籽粒中楊梅素和山奈酚的平均含量分別為(53.62±28.61) μg g?1和(23.68±15.00) μg g?1, 與謝文英等人報道的平均含量基本一致[13]; 槲皮素平均含量與余春磊等人報道的花后10 d大麥根、花后25 d大麥葉中的基本一致[21-22]。

在相同發(fā)育時期、不同材料間化合物的含量存在較大差異, 如花后5、10和15 d等前4個時期二氫楊梅素在光頭大麥中均未被有效檢測, 但在花后25 d、30 d和成熟籽粒中其含量分別達(dá)到了45.23、18.18和2.34 μg g?1?；衔锖康牟町惐厝粚?dǎo)致組內(nèi)方差增大, 從而降低其組間達(dá)到顯著水平的概率。因此15個化合物中只有曲克蘆丁、二氫槲皮素和木犀草素等7個化合物在不同時期間的含量差異達(dá)到了顯著或極顯著水平。

影響大麥籽粒中黃酮類化合物相對含量的因素主要包括籽粒重量增速(主要是淀粉含量增速)、化合物合成效率和衰減效率(降解速率和轉(zhuǎn)化速率), 但少有相關(guān)研究報道。王芳等[23]發(fā)現(xiàn)花后5~8 d左右小麥籽粒淀粉含量急劇增加, 花后20~25 d增速減慢、直到成熟期淀粉含量方可達(dá)到最高。小麥淀粉合成關(guān)鍵酶基因, 如、和等在花后13 d表達(dá)量最高、隨后下降, 4種酶在5~8 d有較高水平表達(dá)、在花后20~25 d達(dá)到最高[24]。羅小嬌等[25]發(fā)現(xiàn)大麥籽粒中黃酮類化合物合成關(guān)鍵酶基因, 如查爾酮合成酶基因在花后2 d表達(dá)量最大、隨后維持較低表達(dá)量; 4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)基因在花后4 d的籽粒中表達(dá)量最高、花后8 d后基本不檢測到該基因的表達(dá)[26]。因此, 在黃酮類化合物代謝酶活性已衰減、甚至失活時淀粉含量仍可快速增加, 從而導(dǎo)致了大麥籽粒黃酮類化合物的相對含量下降。

在曲克蘆丁、二氫槲皮素和木犀草素等7個化合物中, 曲克蘆丁和白楊素處于苯丙烷代謝分支途徑的下游或末端位置, 其積累模式較為相似, 為上升—下降—平臺—下降模式。作者認(rèn)為在花后5~10 d兩種化合物合成效率高于淀粉的合成效率, 因此其相對含量不斷增加。在花后10 d以后淀粉合成效率提高、2種化合物的下游修飾反應(yīng)已被激活, 在2種因素作用下該化合物含量急劇下降。當(dāng)?shù)矸酆铣尚授呌诜€(wěn)定、修飾產(chǎn)物濃度增加并形成反饋抑制后, 2種化合物的相對含量降速趨緩、進(jìn)入平臺期。在平臺期末, 2種化合物的合成速率下降、淀粉持續(xù)高效合成, 從而再次導(dǎo)致2種化合物的相對含量再次下降。柚皮素查爾酮屬苯丙烷代謝上游中間產(chǎn)物、其催化產(chǎn)物構(gòu)成了黃酮醇、異黃酮和花色苷等下游多種化合物的合成分支途徑。在花后5 d其下游合成反應(yīng)已被有效啟動并導(dǎo)致該化合物含量急劇下降。由于需要高含量的柚皮素查爾酮維持下游產(chǎn)物合成, 其合成效率仍需維持較高水平, 因此在15~30 d 淀粉合成效率較高時其相對含量并未急劇下降, 從而進(jìn)入平臺期。在平臺期末, 柚皮素查爾酮及其下游合成均降低、但淀粉仍持續(xù)高效合成, 從而再次降低了該化合物的相對含量。二氫槲皮素、木犀草素、芹菜素和短柄花素4種化合物均屬苯丙烷代謝途徑下游中間產(chǎn)物, 其下游合成反應(yīng)啟動相對較晚, 花后10、15甚至25 d其含量仍可維持較高水平。當(dāng)下游反應(yīng)被激活、淀粉合成效率還較高時, 其相對含量便急劇下降。由于下游分枝途徑較多、難以形成有效的協(xié)同反饋抑制, 因此其含量可隨淀粉含量的增加和下游反應(yīng)推進(jìn)而持續(xù)下降、直至籽粒成熟。

A~G: 柚皮素查爾酮、曲克蘆丁、二氫槲皮素、木犀草素、芹菜素、短柄花素和白楊素; T1~T7: 花后5、10、15、20、25、30 d和成熟籽粒。

A–G: naringenin chalcone, troxerutin, dihydroquercetin, luteolin, apigenin, formononetin, and chrysin. T1?T7: on the 5th, 10th, 15th, 20th, 25th, 30th day after anthesis and at mature stage, respectively.

7種化合物含量分析結(jié)果表明, 大麥籽粒發(fā)育進(jìn)程中曲克蘆丁、二氫槲皮素和木犀草素等7種化合物的最高含量出現(xiàn)在不同時期, 如曲克蘆丁的最高含量出現(xiàn)在花后10 d、二氫槲皮素的最高含量出現(xiàn)花后15 d。與最高含量相比, 至少在2個時期化合物的含量顯著或極顯著偏低。因此, 在大麥籽粒7種化合物的含量測定、及其積累機制和生理功能研究中曲克蘆丁、芹菜素、短柄花素和白楊素的適宜取樣期為花后10 d, 柚皮素查爾酮、二氫槲皮素和木犀草素的適宜取樣期分別為花后5、15和25 d。

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[24] 譚彩霞, 封超年, 郭文善, 朱新開, 李春燕, 彭永欣. 花后不同時期高溫處理下小麥籽粒的淀粉合成及相關(guān)酶基因表達(dá). 核農(nóng)學(xué)報, 2012, 26: 1311–1316. Tan C X, Feng C N, Guo W S, Zhu X K, Li C Y, Peng Y X. Effect of high temperature during different growth stage after anthesis on starch synthesis and related enzyme gene expression in wheat grains., 2012, 26: 1311–1316 (in Chinese with English abstract).

[25] 羅小嬌, 劉新春, 楊曉云, 袁金娥, 馮宗云. 青稞C4H基因的克隆及組織表達(dá)分析. 植物遺傳資源學(xué)報, 2014, 15: 589–596.Luo X J, Liu X C, Yang X Y, Yuan J E, Feng Z Y. Cloning and tissue expression analysis of HvC4H gene in Hulless barley., 2014, 15: 589–596 (in Chinese with English abstract).

[26] 楊曉云, 楊智敏, 羅小嬌, 孔德媛, 袁金娥, 劉新春, 馮宗云. 青稞4-香豆酸輔酶Ａ連接酶基因的克隆及表達(dá)分析. 麥類作物學(xué)報, 2014, 34: 1603–1610. Yang X Y, Yang Z M, Luo X J, Kong D Y, Yuan J E, Liu X C, Feng Z Y. Cloning and expression analysis of 4-ceoumarate: CoA ligase genein hulless barley., 2014, 34: 1603–1610 (in Chinese with English abstract).

Analysis on the accumulation characteristics of seven flavonoids at grain development stage in barley

HE Jun-Yu, ZHONG Wei, CHEN Yun-Qiong, WANG Wei-Bin, XIONG Jing-Lei, JIANG Ya-Li, SHI Hui-Meng, and CHEN Sheng-Wei*

Collage of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China

The analysis on the accumulation characteristics of flavonoids in barley grain is helpful for the studies, such as the content detection, accumulation mechanism and physiological function of these compounds. In this study, the contents of 15 flavonoids of eight barley material grains during seven development stages were determined by HPLC. The total contents of 15 compounds were exhibited the trend of up–down variation, reaching the highest value (335.71±41.63) μg g?1on the 10th day after anthesis, and the lowest (165.52±38.63) μg g?1in mature grain. The highest contents of troxerutin, apigenin, formononetin, and chrysin were (155.75±30.76) μg g?1, (8.41±1.54) μg g?1, (10.71±1.53) μg g?1, and (4.41±0.60) μg g?1on the 10th day after anthesis, respectively. The highest contents of naringenin chalcone, dihydroquercetin, and luteolin were (42.41±15.39) μg g?1, (17.92±6.60) μg g?1, and (5.19±1.37) μg g?1on the 5th, 15th, and 25th day after anthesis, respectively. The content of naringenin chalcone was changed with down–platform–down trend during development of barley grain, but the contents of troxerutin and chrysin were changed with up–down–platform–down trend, and the contents of dihydroquercetin, luteolin, apigenin and formononetin were changed with up-down trend. In terms of flavonoids content detection, the appropriate sampling time of for troxerutin, apigenin, formononetin and chrysin in barley grains was 10 days after post-anthesis stage, and the appropriate time of naringenin chalcone, dihydroquercetin, and luteolin was 5, 15, and 25 days after post-anthesis stage. These results can provide the theoretical support for the content detection of flavonoids in barley grains.

barley grain; development stage; flavonoids; accumulation characteristics

10.3724/SP.J.1006.2021.01069

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(32060457)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32060457).

陳升位, E-mail: ynkmcsw@126.com

E-mail: etfiee_coisini@126.com

2020-08-28;

2021-01-14;

2021-02-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210219.1454.004.html