小麥lncRNA27195及其靶基因TaRTS克隆及表達分析

王 娜 白建芳 馬有志 郭昊宇 王永波 陳兆波 趙昌平* 張立平*

小麥lncRNA27195及其靶基因TaRTS克隆及表達分析

王 娜1,2,**白建芳2,**馬有志1郭昊宇2王永波2陳兆波2趙昌平2,*張立平2,*

1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100087;2北京市農(nóng)林科學院北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心/ 雜交小麥分子遺傳北京市重點實驗室, 北京 100097

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一種大于200 bp的非編碼RNA, 大量存在于植物體中, 其可通過調(diào)節(jié)基因表達或蛋白功能, 在植物生長發(fā)育與脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。前期在研究光照和溫度對小麥光溫敏核雄性不育系BS366育性誘導中, 利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選獲得與育性相關(guān)的lncRNA ()為研究小麥的功能, 本研究在BS366中克隆及其靶基因, 并對進行生物信息學分析, 結(jié)果顯示,基因全長315 bp, 編碼104個氨基酸, 且發(fā)現(xiàn)該RTS蛋白僅存在于禾本科植物中。通過實時熒光定量PCR, 對及基因在不同組織不同光溫處理及茉莉酸甲酯處理下進行表達模式分析, 發(fā)現(xiàn)和均在雄蕊中高表達, 呈顯著的正相關(guān), 且兩者在不同光溫條件下呈現(xiàn)出不同的表達模式。光照和溫度均對和有調(diào)控作用, 適當濃度的MeJA促進兩者的表達, SA抑制兩者表達。以上結(jié)果表明, 在光周期、溫度和植物激素的誘導下,正向調(diào)節(jié)基因表達, 進而影響花粉育性, 本研究結(jié)果有助于促進對小麥光溫敏核型雄性不育系的機理研究和生產(chǎn)應(yīng)用。

lncRNA; RTS蛋白; 花藥; 雄性不育

長鏈非編碼RNA (long non-cording RNA), 是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA, 通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄[1]。研究表明lncRNA可與DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子相互作用, 從而調(diào)節(jié)基因表達, 并通過多種機制發(fā)揮功能。在轉(zhuǎn)錄水平上, lncRNA可以招募轉(zhuǎn)錄因子, 調(diào)控相鄰基因的表達[2-3]; 在表觀遺傳水平上, lncRNA可以通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)目的基因的表達[4-5]; 在轉(zhuǎn)錄后水平上, lncRNA可通過與靶mRNA的互補堿基配對調(diào)控mRNA各方面的功能, 類似于微小RNA, 如microRNA和snoRNA[6]。目前, 在擬南芥[7]、小麥[8]、水稻[9-10]、玉米[11]、番茄[12]等植物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了lncRNA, 并發(fā)現(xiàn)他們具有重要的作用, 可調(diào)控一系列重要生物途徑, 包括生長代謝、激素信號、逆境脅迫響應(yīng)、生殖發(fā)育和維護基因組完整性等。在水稻中, 研究人員發(fā)現(xiàn)可調(diào)控光敏雄性不育水稻的lncRNA (), 在長日條件下高表達可保持花粉正常發(fā)育。而突變體中,的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 導致啟動子區(qū)域的甲基化程度提高, 從而降低轉(zhuǎn)錄水平, 導致長日條件下花藥絨氈層細胞提早發(fā)生程序性死亡, 進而引起光敏雄性不育[9-10]。二系雜交小麥主要是通過環(huán)境條件的改變可以調(diào)控植物的雄性育性轉(zhuǎn)換[13]。光溫敏核雄性不育小麥既可作為雄性不育系, 也可發(fā)揮保持系的作用, 是目前雜種優(yōu)勢利用的主要方式, 因此小麥光溫敏核雄性不育基因的挖掘和研究具有重要意義。

RTS蛋白, 是一個花藥特異性蛋白, 只在絨氈層細胞中特異性表達。研究發(fā)現(xiàn)水稻基因的下調(diào)表達會導致花粉敗育, 從而引起水稻雄性不育[14]。絨氈層位于四層花藥細胞的最內(nèi)層, 對花粉的發(fā)育至關(guān)重要[15]。在絨氈層發(fā)育過程中絨氈細胞的程序性死亡對原染色體的形成、孢粉素的合成至關(guān)重要[16]。絨氈層結(jié)構(gòu)破損會導致花粉失活, 引起雄性不育。例如, 擬南芥的、雙突變體的花藥缺乏絨氈層的生成, 導致小孢子母細胞無法在減數(shù)分裂后正常發(fā)育, 導致小孢子敗育和雄性不育[17]。前期通過對光照和溫度誘導的可育環(huán)境和不育環(huán)境的BS366光溫敏核雄性不育小麥的花藥進行l(wèi)ncRNA測序, 并對育性相關(guān)差異表達的lncRNA進行篩選。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果發(fā)現(xiàn)及其靶基因()在可育和不育環(huán)境中表達差異較明顯。因此, 本研究克隆及其靶基因通過對其進行生信分析、組織特異性和時空表達分析, 并分析其在不同育性條件下和非生物脅迫下的表達模式, 為進一步闡明長鏈非編碼RNA在光溫敏雄性不育小麥育性轉(zhuǎn)換過程中的調(diào)控模式提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為光溫敏核雄性不育系冬小麥BS366, 由北京市農(nóng)林科學院北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心提供。BS366表現(xiàn)出光溫敏感性育性, 在不育環(huán)境(花粉發(fā)育階段日平均溫度12℃, 12 h光照/12 h黑暗)下, 花粉失活, 結(jié)實率<5%; 在可育環(huán)境(花粉發(fā)育階段日平均溫度20℃, 14 h光照/10 h黑暗)下, 花粉發(fā)育正常, 育性恢復(fù)至40%～55%。所有植物均種植于花盆, 放置在北京的實驗田, 并進行常規(guī)管理, 至四葉一心期放入人工氣候箱。

1.2 試驗方法

1.2.1基因及基因的克隆

各組織RNA提取按照TRIzol Reagent (Invitrogen)說明書進行。RNA經(jīng)濃度和純度鑒定后合格放置–80℃?zhèn)溆?。利用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學的分析結(jié)果, 根據(jù)基因序列和基因()序列利用Primer premier 5軟件設(shè)計引物(表1), 以BS366花藥組織樣品cDNA為模板克隆及基因全長。擴增體系為: 2× Phanta Max Buffera 25 μL, dNTP Mix (10 mmol L–1each) 1 μL, 上游引物(10 μmol L–1) 1 μL, 下游引物(10 μmol L–1) 1 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 19 μL。PCR擴增程序為: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性15 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸15 s; 72℃延伸10 min, 4℃保存。按照pBackZero-T Vector Cloning Kit說明書, 將全長序列與基因的CDS序列克隆至pBackZero-T載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α, 挑取陽性單克隆菌, 對目標片段進行測序, 并將甘油菌保存于–80℃冰箱。

表1 引物設(shè)計

1.2.2基因生物信息學分析 利用ExPASy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測軟件對基因進行一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析。利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線預(yù)測軟件對基因進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測軟件對基因進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。利用Prot Scale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale.pl)在線預(yù)測軟件對基因進行親疏水性分析。利用TargetP 1.1 Server (http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php)在線預(yù)測軟件進行亞細胞定位的預(yù)測。利用PlantCARE在線預(yù)測軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)預(yù)測其啟動子元件。利用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Ensembl Plant網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org/Multi/ Tools/Blast)進行同源基因的查找。通過DNAMAN軟件進行多序列比對。利用MEGA6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建, 采用鄰接法(neighbor joining method), 其中, Bootstrap值設(shè)置為1000, 其余均為默認參數(shù)。

1.2.3基因亞細胞定位 將的ORF序列克隆到載體上, 構(gòu)建融合表達載體。將融合載體轉(zhuǎn)化到新制備的小麥原生質(zhì)體中, 以轉(zhuǎn)化的小麥原生質(zhì)體作為對照, 將融合載體轉(zhuǎn)化的小麥原生質(zhì)體細胞在激光共聚焦顯微鏡(Leica, 德國)下觀察綠色熒光信號在原生質(zhì)體中的分布。

1.2.4 表達模式分析 組織特異性分析: 在抽穗期采集BS366小麥的根、莖、葉、穎殼、雄蕊和雌蕊樣品, 置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆? 進行組織特異性表達分析。不同育性環(huán)境對基因表達模式影響分析: 在四葉期結(jié)束后(育性敏感期), 將長勢良好且一致BS366植株分為兩組, 分別在可育環(huán)境(20℃, 14 h L/10 h D; L/D為光照/黑暗)和不育環(huán)境(12℃, 12 h L/12 h D)條件下, 相對濕度為60%～80%的人工氣候培養(yǎng)箱(CLC-BIV-M/CLC404-TV, MMM, 德國)中培養(yǎng)。根據(jù)葉齡和花藥長度, 采集BS366在兩個不同生育條件下的孢子母細胞時期(S1)、二分體時期(S2)、四分體時期(S3)和單核期(S4)的花藥組織, 置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。不同光溫對基因表達模式影響分析: 將育性敏感期長勢良好且一致BS366植株分為4組, 分別在低溫長日環(huán)境(12℃, 14 h L/10 h D)、低溫短日環(huán)境環(huán)境(12℃, 12 h L/12 h D)、高溫長日環(huán)境(20℃, 14 h L/10 h D)、和高溫短日環(huán)境(20℃, 12 h L/12 h D)條件下中培養(yǎng)約2周, 至抽穗期, 采集花藥組織, 置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。茉莉酸甲酯對基因表達模式調(diào)控分析: BS366正常生長20℃ (12 h L/12 h D)至抽穗期, 每天噴施茉莉酸甲酯(MeJA), 濃度分別為0、0.5、2和4 mmol L?1, 連續(xù)5 d后, 同時用10 mmol L?1水楊酸(SA)噴施MeJA處理后的小穗, 采集花藥組織, 置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)基因和基因的序列設(shè)計qPCR引物(表1), 以上述樣品RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 以為內(nèi)參基因, 在(CFX96; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)平臺使用TB Green Premix Ex(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行qPCR分析。反應(yīng)體系為: TB GreenPremix Ex(Tli RNaseH Plus) (2′) 5 μL, cDNA 1 μL, 上游引物(10 μmol L?1) 0.5 μL, 下游引物(10 μmol L?1)0.5 μL, ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序為: 預(yù)變性95℃5 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 45個循環(huán); 溶解曲線分析95℃15 s, 55℃ 1 min, 95℃15 s。數(shù)據(jù)按照2–ΔΔCt法計算相對表達量, 生物學重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均為3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA27195及TaRTS基因的克隆

以BS366的花藥cDNA為模板克隆與基因的CDS序列, 電泳結(jié)果與網(wǎng)上公布的同序列大小基本一致，分別為396 bp和315 bp (圖1)。將克隆至pBackZero-T載體上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 挑取陽性單克隆菌, 并進行測序,結(jié)果同前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(圖2)。

2.2 TaRTS基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

小麥的基因位于3D染色體上, CDS序列長315 bp, 編碼104個氨基酸。通過Ensambl搜索比對, 發(fā)現(xiàn)其在3A和3B上存在等位基因和。TaRTS蛋白分子量為10.08 kD; 等電點為7.54, 為堿性蛋白質(zhì); 共1389個原子; 半衰期為30 h; 不穩(wěn)定指數(shù)為30.16, 為穩(wěn)定蛋白; 脂肪族指數(shù)為77.31; 總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity)為0.497; 有4個帶負電荷的氨基酸殘基, 包括3個天冬氨酸(Asp)和1個谷氨酸(Glu), 有5個帶正電荷的氨基酸殘基, 包括4個精氨酸(Arg)和1個賴氨酸(Lys)。利用Prot Scale在線軟件測得TaRTS蛋白的氨基酸殘基整體為疏水性, 同理化性質(zhì)分析一致, 推測為疏水性蛋白(圖3-A)。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示, 該蛋白由41個α-螺旋(39.42%)、12個延伸鏈(11.25%)、9個β-轉(zhuǎn)角(8.65%)和42個無規(guī)則卷曲(40.38%)組成(圖3-B)。蛋白三級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋(圖3-C)。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示TaRTS蛋白為分泌蛋白。此外, 小麥原生質(zhì)體亞細胞定位顯示, 綠色熒光蛋白GFP在小麥原生質(zhì)體中瞬時高效表達, 表明TaRTS蛋白定位于原生質(zhì)體的細胞質(zhì)部分, 符合預(yù)測結(jié)果(圖4)。

2.3 TaRTS基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

研究結(jié)果顯示僅在水稻(Group)、粟()、山羊草()、二穗短柄草()、哈氏黍()和狗尾草()這些禾本科植物中發(fā)現(xiàn)同源基因, 表明基因家族是一種禾本科特有基因。多序列比對結(jié)果顯示,基因家族的保守性較差, 但具有保守的半胱氨酸位點(圖5-A)。利用MEGA 6.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 顯示基因與二穗短柄草的同源性較高, 同粟、狗尾草同源性較低(圖5-B)。

藍色為α-螺旋, 綠色為β-轉(zhuǎn)角, 紅色為延伸鏈, 紫色為無規(guī)則卷曲。

Blue line means alpha helix, green line means beta turn, red line means extended strand, and purple line means random coil.

2.4 TaRTS基因啟動子元件分析

對基因啟動子區(qū)前2000 bp序列的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測分析發(fā)現(xiàn), 基因的啟動子序列中包含: 光響應(yīng)元件(ACE, G-box, GT1-motif, T-box, Sp1)、分生組織表達有關(guān)(CAT-box)、MYBHv1結(jié)合位點(CCAAT-box)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif, TGACG-motif)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、細胞周期調(diào)控元件(MSA-like)等元件。推測基因與光、溫脅迫, 調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)(表2)。

2.5 lncRNA27195及TaRTS組織特異性分析

本實驗研究了與基因在小麥孕穗期(挑旗)根、莖、旗葉、穎殼、雄蕊和雌蕊不同組織的表達譜。結(jié)果顯示,與基因在小麥雄蕊中表達量最高, 顯著高于其他組織(<0.01), 而其他組織中的表達量極低, 表明與在雄蕊上特異性表達, 主要參與花藥發(fā)育的調(diào)控(圖6)。

表2 啟動子元件分析

2.6 lncRNA27195及TaRTS不同花藥發(fā)育時期表達分析

本研究對與基因在不同育性條件下的4個發(fā)育時期的花藥中的表達模式進行了分析。結(jié)果表明,基因在二分體時期、四分體時期和單核期, 可育環(huán)境下的表達量均極顯著高于不育環(huán)境(<0.01)。在二分體時期可育環(huán)境下的表達量極顯著高于不育環(huán)境(<0.01); 在四分體時期和單核期, 可育環(huán)境下的表達量均顯著高于不育環(huán)境(<0.05); 在小孢子母細胞時期, 不育環(huán)境的表達量顯著高于可育環(huán)境(<0.05) (圖7-A)。皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果顯示,同基因的表達量在小麥花藥中呈顯著正相關(guān)(2=0.8724) (圖7-B)。

2.7 lncRNA27195及TaRTS在不同光溫處理下的表達模式分析

前期發(fā)現(xiàn)BS366的育性受光照和溫度的影響, 且生信分析發(fā)現(xiàn)基因啟動子區(qū)包含光和低溫響應(yīng)元件(表2), 因此對不同光照和溫度條件下,與基因在花藥中的表達水平進行分析。結(jié)果顯示, 在高溫長日條件(20℃, 14 h L/10 h D)、高溫短日條件(20℃, 12 h L/12 h D)、低溫長日條件(12℃, 14 h L/10 h D)和低溫短日(12℃, 12 h L/12 h D)條件下, 小麥的相對表達量依次下降, 四個條件下存在顯著性差異; 小麥基因的表達量依次下降, 高溫長日條件、高溫短日和低溫長日條件、低溫短日條件三組間存在顯著性差異(圖8)。此外, 小麥與基因在不同溫度(相同光照)和不同光照(相同溫度)的組別間的數(shù)據(jù)分析中顯示, 兩者皆存在顯著性差異, 且受溫度影響較大。結(jié)果表明, 光照和溫度均對小麥與基因的表達存在顯著影響, 高溫和長日照可以促進與基因的表達, 進而促進育性恢復(fù)。

2.8 lncRNA27195及TaRTS在MeJA及SA處理下的表達模式分析

前期研究表明, MeJA參與小麥雄性不育, 可促進花藥開裂, 同時SA對該功能有一定的拮抗作用; 本文前期的生物信息學分析中發(fā)現(xiàn)基因啟動子區(qū)存在MeJA響應(yīng)元件。為研究MeJA與之間的調(diào)控方式, 以及對的調(diào)控作用, 本研究利用不同濃度的MeJA對抽穗后開花前的花藥進行處理, 同時研究SA噴施MeJA處理后的花藥中,及的表達模式。在MeJA處理后, 隨著濃度的上升,及的表達量先上升后下降, 在MeJA濃度為0.5 mmol L?1時達到峰值; 通過SA噴施處理后, 發(fā)現(xiàn)及的表達量較正常植株顯著下降, 且隨著MeJA濃度的上升,及的表達量不斷下降(圖9)。實驗表明, 適量的MeJA可以促進及的表達, 但過高濃度的MeJA反而會抑制其表達; SA可以抑制MeJA的功能, 從而抑制及的表達。

*代表顯著差異(<0.05), **代表極顯著差異(<0.01)。

* means significantly different at<0.05, and ** means highly significant difference at<0.01.

T1: 溫長日環(huán)境(20℃, 14 h L/10 h D); T2: 高溫短日環(huán)境(20℃, 12 h L/12 h D); T3: 低溫長日環(huán)境(12℃, 14 h L/10 h D); T4為低溫短日(12℃, 12 h L/12 h D)環(huán)境。*代表各組間存在顯著差異(< 0.05)。

T1: long-light environment with high temperature (20℃, 14 h L/10 h D); T2: short-light environment with high temperature (20℃, 12 h L/12 h D); T3: long-light environment with low temperature (12℃, 14 h L/10 h D); T4: short-light environment with low temperature (12℃, 12 h L/12 h D). * means significantly different at< 0.05.

3 討論

在水稻中, 研究表明基因僅在絨氈層中表達, 對花粉發(fā)育至關(guān)重要, 且抑制其表達會導致雄性不育[14]。TaRTS蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), 其丙氨酸含量較高(圖1-A), 其他植物中發(fā)現(xiàn)的一些功能未知的花藥特異性表達蛋白也具有這一特征, 如水稻中的RA8蛋白[18], 擬南芥[19]和油菜花[20]中的Bcp1蛋白。擬南芥基因, 在絨氈層和小孢子中都有表達, 也被證明是花粉發(fā)育所必需的, 其在二倍體絨氈層或單倍體小孢子中的低表達或不表達會導致花粉發(fā)育停滯[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)TaRTS蛋白中富含半胱氨酸, 同家族蛋白也同樣如此(圖5)。半胱氨酸殘基可以通過二硫鍵提供分子內(nèi)和分子間的交聯(lián), 從而形成蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu), 表明該特征對蛋白質(zhì)的功能的發(fā)揮具有重要作用。此外, RTS蛋白的N端存在較強的疏水結(jié)構(gòu)域(圖3), 這種結(jié)構(gòu)域主要與蛋白靶向到膜部分或細胞外空間過程相關(guān)。這些特征也在其他一些花藥特異性蛋白中被觀察到, 如水稻的PS1[21]、玉米的Zmc13[22]和番茄的LAT52[23]。絨氈層主要參與孢粉素的合成和沉積進而釋放到花粉中[24], 本研究中TaRTS蛋白被預(yù)測為分泌蛋白, 亞細胞定位到細胞質(zhì)中(圖4), 因而TaRTS蛋白可能被絨氈層細胞分泌到花粉中, 為花粉壁的形成提供必要的組分, 或者為花粉的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。本研究克隆的基因, 其開放閱讀框(open reading frame, ORF) GC含量較高(72.7%)。Tsuchiya等[25]分離得到的花藥特異性的水稻基因的ORF中顯示出較高的GC含量(70.3%和69.6%)。ORF在其他花藥特異性基因中是否存在GC含量高的現(xiàn)象尚不清楚。然而, 可以推測高GC含量提高植物對環(huán)境脅迫的耐受性, 因為GC之間的氫鍵比AT更穩(wěn)定, 而花藥是環(huán)境脅迫下最脆弱的器官之一。

BS366屬于光溫敏型核雄性不育, 在低溫短日照條件下不育, 高溫長日下可育。本研究表明的啟動子序列同時存在光響應(yīng)元件和低溫響應(yīng)元件(表1), 而及在不同光溫處理下的表達模式顯示,及的表達量存在顯著性差異, 高溫和長日照可以促進與基因的表達(圖8), 可見其同BS366的育性轉(zhuǎn)換存在著密切的聯(lián)系。

茉莉酸甲酯(MeJA)廣泛分布在植物中, 影響果實成熟、失活花粉的產(chǎn)生、根的生長、卷須卷曲、植物對傷害和非生物脅迫的反應(yīng), 以及對昆蟲和病原體的防御等過程[26]。Mandaokor等[27]的研究顯示, 控制擬南芥的雄蕊發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYB21和MYB24受茉莉酸甲酯調(diào)控。在擬南芥突變體中發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯含量低, 花藥開裂異常, 花絲伸長未能正常進行、花粉發(fā)育延遲, 導致雄性不育[28], 表明茉莉酸與花藥育性直接相關(guān)。同時, 水楊酸(SA)和JA途徑相互影響, SA的積累可以抑制JA的表達[29], WIPK蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達可以激活JA的生成, 且抑制SA通路的信號傳導[30]。本研究中利用MeJA和SA對抽穗期的小麥進行噴施處理的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), 0.5 mmol L?1的MeJA可以促進及的表達, SA的噴施可以抑制MeJA的功能, 從而抑制及的表達, 表明了及受到MeJA介導的JA信號通路調(diào)控(圖9)。

本研究通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn), RTS蛋白目前僅在禾本科植物中有報道, 其他的植物中無相關(guān)序列報道。其原因可能是由于, 禾本科的進化路線是由蟲媒傳粉向風媒傳粉演化并且高度特化,花被和雄蕊簡化, 因而推測RTS蛋白的出現(xiàn)是為了保證雄蕊的正常發(fā)育, 但其具體功能機制尚不可知[31]。此外,與基因均在雄蕊中特異性表達(圖6), 且兩者間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖7-B), 說明兩者參與花粉的生長發(fā)育。另外與基因在可育環(huán)境的表達量二分體時期, 達到峰值后表達量下調(diào); 在不育環(huán)境則是在小孢子母細胞時期表達量達到峰值, 之后表達量下調(diào)(圖7-A), 表達峰值較正常植株提前一個時期。另外前人研究表明, 絨氈層程序性死亡的提前和推遲會導致花粉失活, 植株發(fā)生雄性不育[32-33]。光周期敏感基因雄性不育水稻(農(nóng)研58)的花粉退化過程與絨氈層的異常行為密切相關(guān), 光敏雄性不育(PGMS)植株較正常植株提前進行絨氈層程序性死亡, 但絨氈層退化進展緩慢, 直到花粉分解才完全退化[34]。本研究表明, TaRTS蛋白作為分泌蛋白, 其基因表達峰值較正常植株提前, 從而可能導致絨氈層提前降解, 導致花粉敗育。

4 結(jié)論

和其靶基因是小麥花藥特異性基因, 通過生物信息學分析及表達水平分析顯示, 兩者表達量呈正相關(guān)關(guān)系, 參與花粉育性調(diào)節(jié), 為分泌蛋白, 且受MeJA調(diào)控, 可伴隨絨氈層凋亡分泌到花粉中, 為花粉壁的形成提供必要的組分, 為花粉的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。

[1] Espinoza C A, Goodrich J A, Kugel J F. Characterization of the structure, function, and mechanism of B2 RNA, an ncRNA repressor of RNA polymerase II transcription., 2007, 13:583–596.

[2] Sigova A A, Mullen A C, Molinie B, Gupta S, Orlando D A, Guenther M G, Almada A E, Lin C, Sharp P A, Giallourakis C C, Young R A. Divergent transcription of long noncoding RNA/mRNA gene pairs in embryonic stem cells., 2013, 110:2876–2881.

[3] Miao S, Lee K W. From discovery to function: the expanding roles of long non-coding RNAs in physiology and disease., 2015, 36:25–64.

[4] Rinn J L, Kertesz M, Wang J K, Squazzo S L, Xu X, Brugmann S A, Henry Goodnough L, Helms J A, Farnham P J, Segal E, Chang H Y. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in humanloci by noncoding RNAs., 2007, 129:1311–1323.

[5] Kristina P S, Thomassen M, Tan Q, Martin B, Torben A K. Long non-coding RNAis an independent prognostic marker of metastasis in estrogen receptor-positive primary breast cancer., 2013, 142:529–536.

[6] Reis E M, Nakaya H I, Louro R, Canavez F C, Flatschart A V, Almeida G T, Egidio C M, Paquola A C, Machado A A, Festa F, Yamamoto D, Alvarenga R, da Silva C C, Brito G C, Simon S D, Moreira Filho C A, Leite K R, Camara Lopes L H, Campos F S, Gimba E, Vignal G M E, Dorry H, Sogayar M C, Barcinski M A, da Silva A M, Verjovski Almeida S. Antisense intronic non- coding RNA levels correlate to the degree of tumor differentiation in prostate cancer., 2004, 23: 6684–6692.

[7] Swiezewski S, Liu F, Magusin A, DeanC. Cold-induced silencing by long antisense transcripts of anPolycomb target., 2009, 462: 799–802.

[8] Xin M M, Wang Y, Yao Y Y, Song N, Hu Z, Qin D D, Xie C J, Peng H R, Ni Z F, Sun Q X. Identification and characterization of wheat long non-protein coding RNAs responsive to powdery mildew infection and heat stress by using microarray analysis and SBS sequencing.,2011,11:61.

[9] Ding J, Lu Q, Ou-Yang Y, Mao H, Zhang P, Yao J, Xu C, Li X, Xiao J, Zhang Q. A long noncoding RNA regulates photoperiod-sensitive male sterility, an essential component of hybrid rice., 2012, 109:2654–2659.

[10] Zhou H, Liu Q J, Li J, Jiang D, Zhou L, Wu P, Lu S, Li F, Zhu L, Liu Z, Chen L, Liu Y, Zhuang C. Photoperiod- and thermo- sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA., 2012, 22:649–660.

[11] Dai X Y, Yu J J, Zhao Q, Zhu D, Ao G. Non-coding RNA for, a pollen-specific gene of., 2004, 46:497–504.

[12] Liu C M, Muchhal U S, Raghothama K G. Differential expression of, a phosphate starvation-induced gene in tomato., 1997, 33:867–874.

[13] 趙昌平, 王新, 張風廷, 葉志杰, 戴惠君. 雜種小麥的研究現(xiàn)狀與光溫敏二系法. 北京農(nóng)業(yè)科學,1999, 17(2):3–5. Zhao C P, Wang X, Zhang F T, Ye Z J, Dai H J. Research status of hybrid wheat and the photosensitive two-system method., 1999, 17(2): 3–5 (in Chinese with English abstract).

[14] Luo H, Lee J Y, Hu Q, Nelson-Vasilchik K, Eitas T K, Lickwar C, Kausch A P, Chandlee J M, Hodges T K., a rice anther- specific gene is required for male fertility and its promoter sequence directs tissue-specific gene expression in different plant species., 2006, 62:397–408.

[15] Kelliher T, Walbot V. Hypoxia triggers meiotic fate acquisition in maize., 2012, 337:345–348.

[16] Shi J, Cui M, Yang L, Kim Y J, Zhang D B. Genetic and biochemical mechanisms of pollen wall development., 2015, 20: 741–753

[17] Julian I S.somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation., 2005, 17:3350–3361.

[18] Jeon J S, Chung Y Y, Lee S, Yi G H, Oh B G, An G. Isolation and characterization of an anther-specific gene,, from rice (L.)., 1999, 39:35–44.

[19] Xu H, Knox R B, Philip E T, Singh M B., a gene required for male fertility in., 1995, 92:2106–2110.

[20] Theerakulpisut P. Isolation and developmental expression of, an anther-specific cDNA clone in., 1991, 3:1073–1084.

[21] Zou J T, Zhan X Y, Wu H M, Wang H, Cheung A Y. Characterization of a rice pollen-specific gene and its expression., 1994, 81:552–561.

[22] Hanson D D, Hamilton A D, Travis L J, Bashe D M, Mascarenhas J P. Characterization of a pollen-specific cDNA cloneand its expression., 1989, 1:173–179.

[23] Twell D, Wing R, Yamaguchi J, McCormick S. Isolation and expression of an anther-specific gene form tomato., 1989, 217:240–245.

[24] McCormick S. Male gametophyte development., 1993, 5:1265–1275.

[25] Tsuchiya T, Toriyama K, Nasrallah M E, Ejiri S. Isolation of genes abundantly expressed in rice anthers at the microspore stage.,1992, 20:1189–1193.

[26] Creelman R A, Mullet J E. Biosynthesis and action of jasmonates in plants., 1997, 48: 355–381.

[27] Mandaokar A, Thines B, Shin B, Lange B M, Choi G, Koo Y J, Yoo Y J, Choi Y D, Choi G, Browse J. Transcriptional regulators of stamen development inidentified by transcriptional profiling., 2006, 46: 984–1008.

[28] Muruáis G, Lalioti V, Sandoval I V. The Cdk5 inhibitor roscovitine strongly inhibits glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes without altering GLUT4 translocation from internal pools to the cell surface., 2009, 220: 238–244.

[29] Seo S, Okamoto N, Seto H, Ishizuka K, Sano H, Ohashi Y. Tobacco map kinase: a possible mediator in wound signal- transduction pathways., 1995, 270:1988–1992.

[30] Seo S, Sano H, Ohashi Y. Jasmonate-based wound signal transduction requires activation of WIPK, a tobacco mitogen-activated protein kinase., 1999, 11:289–298.

[31] 韓建國, 樊奮成, 李楓. 禾本科植物的起源、進化及分布. 植物學報,1996,1:10–14. Han J G, Fan F C, Li F. Origin, evolution and distribution of the Gramineae., 1996,1:10–14 (in Chinese with English abstract).

[32] Yu J, Meng Z, Liang W, Behera S, J?rg K, Tucker M R, Luo Z, Chen M, Xu D, Zhao G, Wang J, Zhang S, Kim Y J, Zhang D. A rice Ca2+binding protein is required for tapetum function and pollen formation., 2016, 176:1772–1786.

[33] Kapoor S. Silencing of the tapetum-specific zinc finger genecauses premature degeneration of tapetum and pollen abortion in Petunia., 2002, 14: 2353–2367.

[34] Shi Y, Zhao S, Yao J. Premature tapetum degeneration: a major cause of abortive pollen development in photoperiod sensitive genic male sterility in rice., 2010, 51: 774–781.

Cloning and expression analysis ofand its target genein wheat (L.)

WANG Na1,2,**, BAI Jian-Fang2,**, MA You-Zhi1, GUO Hao-Yu2, WANG Yong-Bo2, CHEN Zhao-Bo2, ZHAO Chang-Ping2,*, and ZHANG Ling-Ping2,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100087, China;2Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat, Beijing 100097, China

Long non-coding RNA (lncRNA) is a non-coding RNA length over 200 bp, which is abundant in plants. It plays important roles in plant growth, development, and stress response by regulating gene expression or protein function. In the previous study, a fertility-related lncRNA namedwas screened and obtained by transcriptome sequencing from the anther of wheat Photoperiod-thermo Sensitive Genic Male Sterility (PTGMS) line BS366. To investigate the function ofin wheat, thegene and its target genewere cloned from BS366. Bioinformatics analysis were performed on. The expressions ofandin different tissues and their expression correlation between them were analyzed by qRT-PCR. Meanwhile, the expression patterns ofandunder different light and temperature treatments, and methyl jasmonate (MeJA) treatments were investigated. The results showed that thegene with 315 bp length, encoded 104 amino acids. Additionally, RTS proteins were only found as anther-specific proteins in gramineae plants. Bothandwith a significantly positive correlation were highly expressed in stamens, and revealed different expression patterns in different fertility environments. The results demonstrated that the expression ofandwere also regulated by light and temperature. In addition, we found that the appropriate concentration of MeJA could promote the expression ofandwhile SA could inhibit the expression. The results indicated that under the induction of photoperiod, temperature, and plant hormones,positively regulatedgene expression, resulting in affecting pollen development and male fertility. This study contributed to the mechanism research and production application of PTGMS wheat.

lncRNA; RTS protein; anther; male sterility

10.3724/SP.J.1006.2021.01071

本研究由北京市自然科學基金項目(6182014), 北京市農(nóng)林科學院杰出科學家項目(JKZX201907), 北京市農(nóng)林科學院青年基金(QNJJ201916), 國家自然科學基金項目(31872881)和北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20180403)資助。

The work was supported by the Natural Science Foundation of Beijing (6182014), the Outstanding Scientist Cultivation Program of BAAFS (JKZX201907), the Foundation for Youths of BAAFS (QNJJ201916), the National Natural Science Foundation of China (31872881), and the Special Project of Science and Technology Innovation Ability Construction of BAAFS (KJCX20180403).

張立平, E-mail: lpzhang8@126.com; 趙昌平, E-mail: cp_zhao@vip.sohu.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

王娜, E-mail: wangna_00@sina.com

2020-09-02;

2021-01-13;

2021-02-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210222.1051.004.html