奶牛乳房炎大腸桿菌的生化鑒定

賈文玉，賈曉峰，王英杰，雷雄偉

( 高臺(tái)縣羅城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 ，甘肅 高臺(tái) 734300)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料甘肅省張掖市高臺(tái)縣巷道鎮(zhèn)殷家莊村六社三個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(區(qū))的129份奶樣，經(jīng)無(wú)菌采集，在甘肅省張掖市高臺(tái)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離、培養(yǎng)觀察后獲得的18份疑似大腸桿菌純培養(yǎng)物。

1.1.2 生物化培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、硝酸鹽、尿素、枸櫞酸、H2S,試 劑：Ehrlich氏試劑，高硫酸鉀飽和溶液、甲基紅試劑、VP試劑、硝酸鹽試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試劑的配制 (1)糖類分解實(shí)驗(yàn)(葡萄糖、乳糖、蔗糖), 用量：各配100 mL。 配方：蛋白胨0.2 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.02 g瓊脂0.3 g、蒸餾水、pH調(diào)至7.4。加入各種糖類各1 g及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%的溴甲酚紫0.1 mL。121℃高壓滅菌10 min。(2)吲哚實(shí)驗(yàn),用量：100 mL, 配方：Dunham氏蛋白胨水溶液：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、蒸餾水150 mL，pH調(diào)至7.6,高壓滅菌，晾干后于4℃保存。 高硫酸鉀飽和液 高硫酸鉀2.65 g，溶解于50 mL蒸餾水中。(3)甲基紅(MR)、VP實(shí)驗(yàn), 用量：100 mL, 配方：葡萄糖蛋白胨水溶液：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、蒸餾水150 mL,pH調(diào)至7.2～7.6, 乙液：氫氧化鉀溶液(氫氧化鉀40 g，蒸餾水150 mL)。裝于棕色瓶中，于4～10℃保存(4)枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)(西蒙氏枸櫞酸鹽), 用量：100 mL； 配方：稱取現(xiàn)成的西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂2.98 g，解熱攪拌溶解于150 mL蒸餾水中，PH調(diào)至6.7～6.9，121℃高壓滅菌15 min制成斜面長(zhǎng)5～6 cm，底長(zhǎng)3～4 cm的斜面培養(yǎng)基，備用。(5)硫化氫試驗(yàn)(三糖鐵培養(yǎng)基), 用量：100mL； 配方：稱取現(xiàn)成的三糖鐵瓊脂(TSI)6.55 g，加熱溶解于150 mL蒸餾水中，煮沸3 min，分裝于16*150 mm試管，PH調(diào)至7.3～7.5，121℃高壓滅菌25 min制成斜面長(zhǎng)5～7 cm，底長(zhǎng)4～5 cm的斜面培養(yǎng)基，備用。 (6)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)(半固體培養(yǎng)基), 用量：100 mL； 配方：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.1 g、瓊脂0.6 g，調(diào)pH至7.6，高壓滅菌。

1.2.2 生化試驗(yàn) (1)吲哚試驗(yàn) 取純培養(yǎng)物接種于Dunham氏蛋白胨水溶液，37℃培養(yǎng)2～3d，脫脂棉上加Ehrlich與高硫酸鉀飽和溶液，置于被檢試管上，離液面1.5 cm，水溶煮沸為止，觀察結(jié)果。 判定標(biāo)準(zhǔn)：脫脂棉上出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性。(2)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 取純培養(yǎng)物接種于枸櫞酸培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18～36 h，觀察結(jié)果。 判定標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為黑色者為陽(yáng)性，以“+”表示。(3)硫化氫試驗(yàn)取純培養(yǎng)物接種于半固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～36 h，觀察結(jié)果。 判定標(biāo)準(zhǔn)：由運(yùn)動(dòng)視為細(xì)菌，可由穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，使周圍的培養(yǎng)基變成渾濁即為陽(yáng)性；無(wú)運(yùn)動(dòng)力的細(xì)菌僅能延穿刺線生長(zhǎng)，周圍的培養(yǎng)基仍然保持澄清即為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 經(jīng)細(xì)菌動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，18株菌株中，其中大多數(shù)可由穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，使周圍培養(yǎng)基變成混濁，即為陽(yáng)性；而僅有少數(shù)能延穿刺線生長(zhǎng)，周圍的培養(yǎng)基任然保持澄清，即為陰性。

2.1.2 生化鑒定由上表1可知，18菌株經(jīng)生化鑒定后，其中只有5株為大腸桿菌，分別為W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12，其中5株大腸桿菌在葡萄糖及乳糖培養(yǎng)基上均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在蔗糖培養(yǎng)基上僅產(chǎn)酸或呈陰性，吲哚、MR及硝酸鹽培養(yǎng)基上呈陽(yáng)性，在VP、尿素、枸櫞酸及硫化氫培養(yǎng)基上既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，即為陰性。

表1 乳牛乳房炎大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果

2.2 分析

對(duì)比大腸桿菌科中與獸醫(yī)學(xué)有關(guān)的主要屬的生化鑒定表，細(xì)菌的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)大多數(shù)檢測(cè)為陽(yáng)性，少數(shù)為陰性，判定為腸桿菌屬。

從奶牛乳房炎大腸桿菌生化鑒定的結(jié)果來(lái)看，W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12符合大腸桿菌生化鑒定結(jié)果，故確定為大腸桿菌。

3 討論

通過(guò)對(duì)乳樣經(jīng)無(wú)菌采集、分離培養(yǎng)、觀察后獲得的18份疑似大腸桿菌純培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)生化試驗(yàn)即將該純培養(yǎng)物接種到生化培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，來(lái)鑒定大腸桿菌。細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)中采取了葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、等十種生化培養(yǎng)基，將23株疑似大腸桿菌純培養(yǎng)物分別接種于該十種生化培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)基觀察其實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以1984年版《伯吉氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和1994年版《伯吉氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第9版中相應(yīng)科、屬下的各個(gè)種的生理生化指標(biāo)為依據(jù)，結(jié)果證明只有其中的5株(W1Y49、W1Y20、W1Y14、W2L12)為大腸桿菌，其余的均不是。本實(shí)驗(yàn)還將23株疑似大腸桿菌純培養(yǎng)物穿刺培養(yǎng)到半固體培養(yǎng)基上，通過(guò)觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力，也做出了初步的判斷。