粗穗披堿草1HtS染色體臂特異標(biāo)記開發(fā)

王暉，郭軍，周寶元，汪曉璐，韓冉，徐文競，劉愛峰，李豪圣，劉成，劉建軍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所／農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與栽培重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上的主要糧食作物之一，其生產(chǎn)水平直接影響著國家糧食安全。我國小麥條銹病和葉銹病發(fā)病面積大，常常造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。近年來由于全球氣候變暖，小麥銹病在我國有加重趨勢［1］，因此培育和推廣抗病小麥品種成為最經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的防控措施。長期以來，科學(xué)家們一直致力于抗病資源發(fā)掘和優(yōu)異抗病育種材料創(chuàng)制等研究，也獲得了一批優(yōu)異抗病資源［2，3］。然而由于致病生理小種的變異導(dǎo)致獲得抗病資源的抗性逐漸喪失［4，5］。小麥近緣植物中含有豐富的抗病、抗逆和抗蟲等基因，是小麥育種的優(yōu)異基因源。通過遠(yuǎn)緣雜交可以將近緣植物的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移給小麥，創(chuàng)制小麥-近緣植物異染色體系。這些含小麥近緣植物血緣的異染色體系是拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)、抵御小麥重要病蟲害、增加小麥產(chǎn)量和提升小麥品質(zhì)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［6］。

粗穗披堿草（Elymus trachycaulus，2n＝4x＝28，基因組為StStHtHt）是披堿草屬一個(gè)具有優(yōu)異抗性的物種，高抗大麥黃矮?。?］、小麥白粉?。?］、葉銹?。?，10］和稈銹?。?1］。Sharma和Gill于1983年開展了粗穗披堿草種質(zhì)導(dǎo)入小麥研究，通過胚拯救獲得了一批小麥-粗穗披堿草遠(yuǎn)緣雜交材料［12］。1988—1996年 間，Gill［13］、Morris［7］和Jiang［14］等分別從這些雜交后代材料中篩選并鑒定出了小麥-粗穗披堿草附加系、代換系、易位系和端體系等材料。2005年，F(xiàn)riebe等［8］對(duì)小麥-粗穗披堿草羅伯遜易位系1HtS·1BL進(jìn)行研究，命名了抗葉銹基因Lr55。2013年，劉成［15］和宮文萍［11］等的研究發(fā)現(xiàn)，該易位系不僅同時(shí)近免疫美國和中國的葉銹菌小種，還近免疫我國西南麥區(qū)流行的條銹菌混合小種。因此，該易位系是不可多得的兼抗型材料。

內(nèi)含子是真核生物基因在轉(zhuǎn)錄形成成熟RNA過程中，由蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體識(shí)別并剪切掉的非編碼基因組序列，其內(nèi)部存在各種各樣潛在內(nèi)含子多態(tài)性（potential intron polymorphism，PIP）。Yang等［16］在大麥、高粱、大豆和棉花等59個(gè)物種中開發(fā)了57 658個(gè)PIP標(biāo)記，并建立了PIP標(biāo) 記 數(shù) 據(jù) 庫 （http://ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／）。在有差異的內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子序列上設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增出內(nèi)含子序列的片段進(jìn)行多態(tài)性檢測，稱為內(nèi)含子長度多態(tài)性（intron length polymorphism，ILP）［17］。ILP標(biāo)記具有基因特異性、共顯性、高變且遺傳穩(wěn)定、豐度高等特點(diǎn)，可用于分子輔助育種。研究表明，外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在不同物種的同源基因中基本上是保守的［18］。因此，這使得在沒有參考基因組的物種中開發(fā)ILP標(biāo)記成為可能。截至目前，粗穗披堿草中尚未有ILP標(biāo)記的相關(guān)報(bào)道?；诖?，本研究以小麥-粗穗披堿草1HtS·1BL易位系與中國春ph1b基因缺失突變體雜交回交后代等材料進(jìn)行分子標(biāo)記篩選和驗(yàn)證，開發(fā)了粗穗披堿草1HtS特異的ILP標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料列于表1。其中，序號(hào)1～21的材料由美國堪薩斯州立大學(xué)Friebe教授提供；綿陽11和安岳排燈麥由電子科技大學(xué)楊足君教授提供；光頭小麥由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)王益教授提供；TA5072／CS ph1b BC1F2材料為中國春-粗穗披堿草1HtS·1BL羅伯遜易位系TA5072（以下簡稱1HtS·1BL易位系）與中國春ph1b基因缺失突變體的BC1F1后代材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組總DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取葉片約100 mg放入2 mL離心管（提前加入直徑2 mm的鋼珠）中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192組織研磨機(jī)在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，加入緩沖液FP1 400μL和Tnase 6μL，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min；然后加入緩沖液FP2 130 μL，輕輕混勻，渦旋振蕩1 min，12 000 r／min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；向上清液中加入70%體積的異丙醇，充分混勻，12 000 r／min離心2 min，棄上清，保留沉淀；加入70%的乙醇500μL洗滌DNA，12 000 r／min離心2 min，棄上清，再次用70%的乙醇500μL洗滌一次，步驟與第一次的相同。晾干后，加入ddH2O把DNA溶解成100μL原液，檢測提取DNA的純度和濃度，并用ddH2O將DNA原液稀釋到25 ng／μL，作為進(jìn)行PCR的模板DNA。

1.2.2 染色體第一同源群基因序列生物信息學(xué)分析及引物設(shè)計(jì) 下載中國春參考基因組（https://urgi.versailles.inra.fr／download／iwgsc／IWGSC＿RefSeq＿Assemblies／v1.0／）的1A、1B和1D基因組序列信息和基因注釋，檢索出內(nèi)含子及其所在基因的位置和長度，選擇A、B和D高度同源的基因序列且序列長度小于1 000 bp的內(nèi)含子用于標(biāo)記開發(fā)。根據(jù)檢索到的參考基因，提取內(nèi)含子上、下游各100 bp的DNA序列，合成200 bp的查詢序列。將查詢序列到NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析不同小麥同一內(nèi)含子的長度多態(tài)性。最后，利用Premier 5.0軟件對(duì)查詢序列進(jìn)行批量設(shè)計(jì)引物，使上、下游引物分別落在查詢序列的前、后半段，要求引物長度在18～24 bp之間，預(yù)計(jì)退火溫度Tm值在52～60℃之間，且上游和下游引物的Tm值相差在5℃以內(nèi)。引物GC含量40%～60%，且盡量避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)Dimer、Hairpin、Falseprimer以及6個(gè)堿基配對(duì)的出現(xiàn)。利用小麥族多組學(xué)數(shù)據(jù)網(wǎng) 站 （http://202.194.139.32／blast／viroblast.php）的Blast功能，確定ILP引物的染色體位置。設(shè)計(jì)的引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 根據(jù)引物合成推薦的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。30μL PCR反應(yīng)體系為：25 ng／μL的模板DNA 2.0μL，5 U／μL DNA Taq聚合酶0.3μL，200μmol／L的dNTPs 2.0μL，含Mg2＋的10×PCR緩沖液3.0μL，10μmol／L的上、下游引物各2μL，用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至30μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物電泳及檢測 PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳檢測。PAGE膠每100 mL的配置包括30%丙烯酰胺溶液（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE緩沖液20 mL，10%過硫酸銨溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充至100 mL。電泳完后，PAGE膠在1μg／mL的溴化乙錠溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)下掃描照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的PCR篩選

根據(jù)中國春小麥染色體1A、1B和1D的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)合成了41對(duì)ILP引物。以中國春-粗穗披堿草1Ht附加系和中國春為材料，對(duì)合成的這41對(duì)ILP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，結(jié)果顯示，ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對(duì)引物可以在供試材料中擴(kuò)增出1～2條多態(tài)性條帶（表2），引物ILP 5和ILP 21在供試材料中擴(kuò)增不出條帶或條帶非常微弱，ILP 1、ILP 3和ILP 4等21對(duì)引物在供試材料中沒有擴(kuò)增出多態(tài)性條帶。其中，引物ILP 1—ILP 22的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

2.2 多態(tài)性DNA帶特異性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對(duì)ILP引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的特異性，用這18對(duì)引物對(duì)粗穗披堿草、中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、中國春、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、安岳排燈麥和光頭小麥進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粗穗披堿草和中國春-粗穗披堿草1Ht附加系能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)長度的多態(tài)性條帶，而所有對(duì)照小麥均擴(kuò)增不出這些條帶，因此，這些多態(tài)性條帶可能是粗穗披堿草1Ht染色體特異標(biāo)記，即表明這18對(duì)引物可能可用于追蹤小麥背景中的1Ht染色體。這18對(duì)引物的序列、所在小麥染色體的物理位置、設(shè)計(jì)引物參考的基因及能擴(kuò)增出多態(tài)性片段長度等信息如表2所示。

表2 在中國春-粗穗披堿草1Ht附加系中擴(kuò)增出特異條帶的18對(duì)ILP引物

圖1 引物ILP 1—ILP 22在中國春-粗穗披堿草1Ht附加系和中國春中的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 多態(tài)性DNA帶染色體定位及應(yīng)用

為了驗(yàn)證ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對(duì)ILP引物擴(kuò)增出的特異條帶是否僅存在于粗穗披堿草1Ht染色體上，以中國春為對(duì)照，用這18對(duì)引物對(duì)中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、1St附加系和1HtS·1BL易位系等17份小麥-粗穗披堿草染色體系（表1中序號(hào)3～19的材料）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含粗穗披堿草1HtS染色體的中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、1HtS·1BL易位系和1HtS端體附加系均能擴(kuò)增出上述多態(tài)性條帶，而其余14份小麥-粗穗披堿草染色體系（表1中序號(hào)6～19的材料）擴(kuò)增不出這些多態(tài)性條帶，因此，這些多態(tài)性DNA帶是粗穗披堿草1HtS染色體特異分子標(biāo)記。

為了驗(yàn)證粗穗披堿草1HtS染色體特異分子標(biāo)記對(duì)群體檢測的可用性，用這18對(duì)引物分別對(duì)中國春-粗穗披堿草1HtS·1BL易位系／CS ph1b BC1F2群體材料L1—L151進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這18對(duì)引物均能在部分群體材料（87～103個(gè)單株不等）中擴(kuò)增出目標(biāo)多態(tài)性條帶，因此，這些多態(tài)性DNA帶可以作為檢測涉及粗穗披堿草1HtS的小麥-粗穗披堿草雜交種質(zhì)的分子標(biāo)記。其中，引物ILP 17對(duì)L1—L151中部分材料的擴(kuò)增情況如圖2所示。

圖2 引物ILP 17在雜交分離群體材料中的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 物種染色體特異標(biāo)記建立方法

物種特異標(biāo)記的開發(fā)對(duì)輔助作物遺傳改良具有重要意義［19］。在小麥及小麥遠(yuǎn)緣雜交研究中，使用比較廣泛的分子標(biāo)記是SSR和SNP標(biāo)記。其中，SSR標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于品種一致性鑒定或基因粗定位等研究［20，21］；功能型SNP標(biāo)記是由與表型變異相關(guān)基因衍生的標(biāo)記，具有彌補(bǔ)結(jié)構(gòu)多態(tài)性和功能多樣性之間差距的最大潛力，在物種遺傳多樣性［22］、基因精細(xì)定位和克?。?3］及小麥遠(yuǎn)緣雜交種質(zhì)資源鑒定等［24］方面應(yīng)用潛力巨大。粗穗披堿草是小麥的優(yōu)異基因源，因?yàn)闆]有參考基因組，開發(fā)的分子標(biāo)記比較有限［11，13，25］。內(nèi)含子標(biāo)記在水稻和小麥［26］、簇毛麥［27］等物種中已經(jīng)被廣泛開發(fā)和運(yùn)用，而在粗穗披堿草中全基因組開發(fā)和應(yīng)用尚未有報(bào)道?；诖?，我們開展了該項(xiàng)研究，建立了粗穗披堿草1HtS染色體臂特異標(biāo)記18個(gè)，為小麥背景中1HtS染色質(zhì)檢測提供了新方法。本研究分析小麥基因序列開發(fā)標(biāo)記設(shè)置參數(shù)為內(nèi)含子長度低于1 000 bp，然而實(shí)際開發(fā)出部分粗穗披堿草1HtS特異標(biāo)記的長度超過1 000 bp，這表明粗穗披堿草部分基因內(nèi)含子長度大于小麥，這也暗示，可能可用類似方法開發(fā)小麥族中其他小麥近緣物種染色體特異標(biāo)記。

3.2 粗穗披堿草染色體特異標(biāo)記開發(fā)效率

在粗穗披堿草染色體特異標(biāo)記開發(fā)方面，Morris和Gill［28］建立了粗穗披堿草染色體標(biāo)準(zhǔn)C帶和N帶；Jiang等［14］開發(fā)了可用于檢測粗穗披堿草St基因組的特異探針；宮文萍等［29］建立了可追蹤小麥背景中粗穗披堿草1St、5Ht、6Ht和7Ht的寡聚核苷酸熒光原位雜交（FISH）標(biāo)記。然而，由于C帶、N帶或FISH等細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，或操作步驟繁瑣或需要特殊儀器，并不是所有實(shí)驗(yàn)室都能開展。分子標(biāo)記具有表現(xiàn)穩(wěn)定、操作簡單、不受組織器官或發(fā)育時(shí)期特異性影響等優(yōu)點(diǎn)，被科學(xué)家們廣泛應(yīng)用。Gill等［13］建立了粗穗披堿草染色體特異RFLP標(biāo)記，然而該標(biāo)記的建立涉及放射性同位素，已不常用。宮文萍等［11］建立了粗穗披堿草1Ht染色體特異CAPS標(biāo)記，標(biāo)記開發(fā)效率為1.15%（1／87）。韓冉等［25］建立了粗穗披堿草1Yc染色體特異PLUG標(biāo)記，標(biāo)記開發(fā)效率為5.66%（3／53）。本研究通過生物信息學(xué)開發(fā)基于內(nèi)含子擴(kuò)增多態(tài)性的方法，建立了粗穗披堿草1HtS染色體特異標(biāo)記20個(gè)，標(biāo)記開發(fā)效率為43.90%（18／41），遠(yuǎn)高于基于EST-STS開發(fā)CAPS標(biāo)記［11］和開發(fā)PLUG標(biāo)記［25］等方法的效率。

3.3 物種染色體特異標(biāo)記的用途

Ishikawa等［26］建立了水稻單拷貝基因PLUG標(biāo)記，利用小麥缺體-四體為工具，將這些標(biāo)記錨定到小麥1條或多條染色體上。陳仕勇等［30］建立了10個(gè)四倍體披堿草屬物種核型。陳智華等［31］建立了野生垂穗披堿草SRAP標(biāo)記。苗佳敏等［32］建立了垂穗披堿草SRAP和RAPD標(biāo)記。上述研究建立的物種標(biāo)記僅能鑒定小麥或小麥近緣物種染色體，但不能應(yīng)用于小麥背景中近緣物種染色體鑒定。在檢測小麥背景中粗穗披堿草染色體標(biāo)記方面，雖然基于EST-STS的CAPS標(biāo)記［11］和PLUG標(biāo)記［25］已經(jīng)被建立起來，但建立的標(biāo)記數(shù)量太有限，遠(yuǎn)不能滿足對(duì)含1HtS不同片段長度的小麥-粗穗披堿草易位染色體進(jìn)行鑒定。本研究建立了粗穗披堿草1HtS特異標(biāo)記18個(gè)，極大地豐富和加密了1HtS染色體分子標(biāo)記密度。利用這18個(gè)標(biāo)記鑒定151份群體材料，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)記鑒定出含粗穗披堿草1HtS染色質(zhì)的單株數(shù)為87～103不等，表明這些后代材料中粗穗披堿草染色體易位斷點(diǎn)位置不同，因而，這些標(biāo)記可以用于小麥-粗穗披堿草染色體易位系易位斷點(diǎn)判定。