小偃麥滲入系苗期耐鹽鑒定與分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

喬麟軼，張瀟文，李世姣，陳芳，李欣，郭慧娟，張樹(shù)偉，常利芳，張曉軍，暢志堅(jiān)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006）

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響作物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量。目前我國(guó)東北、西北、黃河三角洲及沿海等地區(qū)的鹽漬化土壤面積高達(dá)3.6×107hm2［1，2］，已成為限制作物增產(chǎn)的主要因素之一。小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主糧作物，隨著人口增長(zhǎng)對(duì)糧食需求的不斷加大，增強(qiáng)小麥對(duì)鹽漬土壤的耐受性進(jìn)而提高其產(chǎn)量，對(duì)于保障國(guó)家的糧食安全意義重大。

廣泛發(fā)掘耐鹽種質(zhì)是選育小麥耐鹽品種的前提。偃麥草屬 （Thinopyrum）植物隸屬禾本科小麥族，可在鹽堿地或?yàn)┩可L(zhǎng)，是小麥抗逆性改良的優(yōu)異基因庫(kù)［3］。長(zhǎng)期以來(lái)，育種家通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交或體細(xì)胞融合技術(shù)將偃麥草遺傳片段導(dǎo)入小麥，創(chuàng)制了小偃麥種質(zhì)，并據(jù)此選育出耐鹽品種用于生產(chǎn)［3-5］。例如源自中間偃麥草 （Th.intermedium）的山農(nóng)120211［6］和源自長(zhǎng)穗偃麥草 （Th.ponticum）的小偃6號(hào)［7］、山融3號(hào)［8］都表現(xiàn)出很好的耐鹽性。其中，山融3號(hào)攜帶的耐鹽基因被定位在5A染色體上［9，10］。

本實(shí)驗(yàn)室自1986年起利用染色體異源重組將中間偃麥草片段轉(zhuǎn)移至普通小麥，創(chuàng)制了TAI7045、TAI7047和TAI8335等多個(gè)八倍體小偃麥新類型［11-13］，并將其與普通小麥品種雜交、回交，獲得一批兼抗小麥白粉病和條銹病的小偃麥新種質(zhì)［14，15］。本研究從小偃麥TAI7047的后代滲入系中選出136份染色體數(shù)目為42的材料進(jìn)行苗期耐鹽性鑒定，并利用分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為小麥耐鹽育種提供新種質(zhì)及耐鹽新抗源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

136份小偃麥滲入系 （晉麥33／TAI7047／／*2京411的F9～F10家系）及其親本用于苗期耐鹽鑒定，小麥品種山融3號(hào)和中國(guó)春分別作為耐鹽和鹽敏感對(duì)照材料。其中，山融3號(hào)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所劉成研究員提供，其余材料均由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 鹽脅迫處理

每份材料取25粒種子，先用1%的雙氧水消毒，再用蒸餾水沖洗干凈，然后放置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)。待胚根伸長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，選擇16粒生長(zhǎng)勢(shì)一致的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的1／2霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)，參數(shù)設(shè)置為16 h光照／8 h黑暗、22℃／16℃；待幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí)更換含NaCl的1／2霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫，再生長(zhǎng)7 d進(jìn)行表型鑒定。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

預(yù)試驗(yàn)設(shè)置0、50、100、150、200、250、300、350 mmol／L NaCl共8個(gè)濃度對(duì)耐鹽對(duì)照山融3號(hào)和鹽敏感對(duì)照中國(guó)春進(jìn)行苗期耐鹽鑒定，選擇兩者耐鹽表型差異最大時(shí)的處理濃度來(lái)鑒定滲入系材料。

1.3 表型鑒定與數(shù)據(jù)分析

參考單雷等［9］的方法，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《小麥耐鹽性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（NYΠPZT0012.2002）將小麥耐鹽級(jí)別劃分為0～4級(jí)，對(duì)每個(gè)材料的16株幼苗分別進(jìn)行小麥葉片的鹽害程度鑒定，并計(jì)算鹽害指數(shù)。計(jì)算方法為：鹽害指數(shù)（%）＝∑（0×0級(jí)苗數(shù)＋1×1級(jí)苗數(shù)＋2×2級(jí)苗數(shù)＋3×3級(jí)苗數(shù) ＋4×4級(jí)苗數(shù)）×100／（5×16）。

根據(jù)鹽害指數(shù)評(píng)價(jià)材料耐鹽性，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：高耐（0～20.0%），耐鹽 （20.1%～40.0%），中耐（40.1%～60.0%），敏感 （60.1%～80.0%）和高感 （80.1%～100.0%）。

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)、作圖以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

采用改良CTAB法［16］提取供試材料及對(duì)照品種的基因組DNA。利用山融3號(hào)耐鹽基因的連鎖分子標(biāo)記Xbarc144（F：5′-GCGTTTTAGGTGGACGACATAGATAGA-3′；R：5′-GCGCCACGGGCATTTCTCATAC-3′）［10］對(duì)小偃麥滲入系進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為10μL：ddH2O 3.5μL，PCR Mixture 5.0μL（B532061，生工生物，中國(guó)上海），引物0.5μL，DNA模板 （100 ng／μL）1.0μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，12℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis＝29∶1）電泳檢測(cè)，硝酸銀染色后照相保存結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期耐鹽鑒定濃度篩選

以耐鹽對(duì)照山融3號(hào)和鹽敏感對(duì)照中國(guó)春為測(cè)試材料，設(shè)置0～350 mmol／L NaCl共8個(gè)濃度進(jìn)行苗期耐鹽鑒定。結(jié)果（圖1）顯示，隨著NaCl濃度的增加，測(cè)試材料的鹽害指數(shù)逐漸增加。在250 mmol／L NaCl濃度下，山融3號(hào)和中國(guó)春的鹽害指數(shù)分別為35.4%和73.6%，差異達(dá)到最大值，因此將250 mmol／L作為對(duì)滲入系材料進(jìn)行耐鹽篩選的鑒定濃度。

圖1 小麥苗期耐鹽鑒定濃度的篩選

2.2 滲入系材料苗期耐鹽鑒定

對(duì)136份小偃麥滲入系及其親本進(jìn)行苗期耐鹽評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，外源親本TAI7047的鹽害指數(shù)為29.26%，具有耐鹽性；而小麥親本晉麥33和京411則表現(xiàn)為鹽敏感，鹽害指數(shù)分別為63.17%和70.83%。小偃麥滲入系中，耐鹽、中耐、敏感、高感材料的數(shù)量分別為9（6.6%）、62（45.6%）、62（45.6%）和3（2.2%）份，其中，有6份滲入系（CH01、CH1631、CH1696、CH1715、CH3286和CH16425）的鹽害指數(shù)低于對(duì)照品種山融3號(hào)，表現(xiàn)出很好的耐鹽性（圖2，表1）。

2.3 苗期耐鹽滲入系的分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

利用山融3號(hào)的耐鹽基因連鎖標(biāo)記Xbarc144對(duì)136份小偃麥滲入系及其親本進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，Xbarc144在鹽敏感小麥親本晉麥33、京411和耐鹽親本TAI7047間存在多態(tài)性，并在小偃麥滲入系中表現(xiàn)出4種標(biāo)記型，其中Xbarc144-a和Xbarc144-b型分別來(lái)自于晉麥33和京411，Xbarc144-c和Xbarc144-d型則來(lái)自于TAI7047（圖3）。然而方差分析結(jié)果 （表2、表3）顯示，4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)的鹽害指數(shù)之間無(wú)明顯差異 （F＝0.27＜F0.05），表明Xbarc144標(biāo)記與這批滲入系的耐鹽表型不連鎖。

圖2 136份小偃麥滲入系的苗期耐鹽等級(jí)和分布

表1 6份耐鹽滲入系及其親本和對(duì)照材料的苗期耐鹽表型和標(biāo)記型

表2 Xbarc144在136份小偃麥滲入系中的4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)鹽害指數(shù)

表3 Xbarc144的4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)表型值的方差分析

圖3 Xbarc144標(biāo)記在部分小偃麥滲入系及其親本中的標(biāo)記型

3 討論

育種家通常將高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病等性狀作為主要育種目標(biāo)，對(duì)耐鹽等抗逆表型的關(guān)注相對(duì)較少。有研究表明，現(xiàn)代小麥品種的整體耐鹽性幾乎沒(méi)有提升，而遺傳多樣性持續(xù)下降，優(yōu)異耐鹽單倍型較為單一［7］。因此，從小麥近緣物種中廣泛發(fā) 掘 耐 鹽 位 點(diǎn) 尤 為 重 要。 例 如Byrt［17］和Munns［18］等從一粒小麥 （Triticum monococcum）的漸滲系中鑒定出一個(gè)主效耐鹽位點(diǎn)Nax2，并確定TmHKT1；5為候選基因，導(dǎo)入TmHKT1；5-A的四倍體小麥在鹽堿地中增產(chǎn)達(dá)25%。而偃麥草屬鹽生植物含有更為豐富的耐鹽基因，本實(shí)驗(yàn)室歷經(jīng)30余年將中間偃麥草片段導(dǎo)入小麥，創(chuàng)制了一大批小偃麥滲入系。本研究對(duì)八倍體小偃麥TAI7047的滲入系進(jìn)行苗期耐鹽鑒定，共篩選出71份耐鹽材料，其中有6份材料的耐鹽性高于對(duì)照品種山融3號(hào)，可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質(zhì)及耐鹽新抗源。

鑒定結(jié)果顯示，這批滲入系的小麥親本晉麥33和京411均為鹽敏感材料，而親本八倍體小偃麥TAI7047則表現(xiàn)為耐鹽，表明耐鹽性來(lái)源于TAI7047。TAI7047中導(dǎo)入了中間偃麥草的2條J染色體、6條Js染色體、3條St染色體和2條Js-St染色體［12，19］，初步猜測(cè)其耐鹽性可能來(lái)源于中間偃麥草，對(duì)此我們將檢測(cè)TAI7047系譜親本的苗期耐鹽表型進(jìn)行驗(yàn)證。

由于小麥耐鹽品種山融3號(hào)的耐鹽基因來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草，而中間偃麥草（JJsSt）與長(zhǎng)穗偃麥草 （JJsJx）具有相似的基因組組成［20］，因此我們用山融3號(hào)耐鹽基因的連鎖標(biāo)記Xbarc144對(duì)小偃麥滲入系進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示滲入系的耐鹽表型與Xbarc144不連鎖，可能包含新的耐鹽位點(diǎn)，這將有助于拓寬小麥的遺傳背景。

4 結(jié)論

利用250 mmol／L NaCl對(duì)136份小偃麥滲入系進(jìn)行苗期耐鹽鑒定，從中選出71份耐鹽材料，其抗性來(lái)自于親本TAI7047。有6份滲入系的耐鹽性（鹽害指數(shù)31.25%～35.94%）略高于對(duì)照品種山融3號(hào) （鹽害指數(shù)38.45%），可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質(zhì)。本研究中滲入系耐鹽表型與山融3號(hào)的耐鹽連鎖標(biāo)記Xbarc144不連鎖，可能具有新的耐鹽位點(diǎn)，拓寬了小麥的耐鹽遺傳背景。