地下水水化學(xué)組成對Fe(Ⅱ)氧化過程中錳氧化菌失活的影響

孫群群，屈婧祎，童 曼，袁松虎

(中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430078)

錳(Mn)是地殼中含量第二高的過渡金屬元素，在還原性地下水中通常以Mn(Ⅱ)存在。當(dāng)環(huán)境受到O擾動時，Mn(Ⅱ)會被氧化為高價錳氧化物。高價錳氧化物因其強(qiáng)氧化能力和強(qiáng)吸附能力，顯著影響著生源元素的循環(huán)、污染物的遷移轉(zhuǎn)化和微生物的厭氧代謝，在多種生物地球化學(xué)過程中具有非常重要的作用。在中性條件下，Mn(Ⅱ)的生物氧化速率比化學(xué)氧化速率快1×10倍，而錳氧化菌是驅(qū)動Mn(Ⅱ)氧化的主導(dǎo)因子。因此，環(huán)境中錳氧化菌的活性對錳的生物地球化學(xué)行為及其主導(dǎo)的其他生物地球化學(xué)過程具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株及其培養(yǎng)

錳氧化模式菌株

Pseudomonas

putida

MnB1購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC),該菌株編號為23483，采用胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)于25℃、220 r/min條件下活化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。先將活化12 h(達(dá)對數(shù)生長期后期)后的MnB1菌液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min并收集菌體，再用5 mmol/L硫酸鈉溶液洗滌3次，最后將菌體重新懸濁，得到初始菌濃度約為1×10CFU/mL的菌液，按照1%的比例加入實(shí)驗(yàn)體系。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

七水合硫酸亞鐵(FeSO·7HO，99.9%)、硫酸鈉(NaSO，99%)、硼酸(HBO，99.5%)、四硼酸鈉(NaBO·10HO，99.5%)、二水合檸檬酸鈉(NaCHO·2HO，99.5%)、草酸(HCO，99.8%)、磷酸三鈉(NaPO·12HO，98%)、氯化鎂(MgCl·6HO，99%)、氯化鈣(CaCl·2HO，99%)均購于中國國藥控股股份有限公司，胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)購于美國BD公司，腐殖酸(HA，C含量為34.2%，N含量為0.75%，S含量為0.30%)購于Sigma Aldrich公司，2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid(MES，99%)購于美國Biosharp公司。其他試驗(yàn)試劑均為分析純或更高純度級別的試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.4 分析方法

(1) 利用平板涂布法計量MnB1菌株活菌數(shù)量。在不同反應(yīng)時間點(diǎn)各取100 μL樣品，逐級連續(xù)稀釋至適當(dāng)濃度后，取100 μL稀釋后的樣品涂布在固體TSB培養(yǎng)基上，每個樣品按2～3個濃度梯度進(jìn)行涂布；涂布后，將培養(yǎng)皿放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面長出明顯菌落后，對菌落數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。

(2) 利用鄰菲咯啉顯色法測定溶解態(tài)Fe(Ⅱ)濃度。在不同反應(yīng)時間點(diǎn)各取1.5 mL樣品，用0.22 μm濾膜過濾至5 μL濃度為6 mol/L HCl中，混勻后取400 μL混合液至160 μL的0.5%鄰菲羅啉溶液中，顯色10 min，加入1 mL乙酸-乙酸銨緩沖液，用去離子水定容至4 mL，搖勻后在510 nm波長下測量吸光度，根據(jù)Fe(Ⅱ)的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出溶解態(tài)Fe(Ⅱ)濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對MnB1菌株失活的影響

不同pH值條件下，F(xiàn)e(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株活菌數(shù)量和Fe(Ⅱ)濃度的變化曲線，見圖1。

圖1 pH值對MnB1菌株活性和溶解態(tài)Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.1 Change curves of MnB1 activity and Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under different pH values注：N0和Nt分別為初始和t時刻MnB1菌株的濃度(CFU/mL),其中N0=1×107CFU/mL；C0和Ct分別為初始和t時刻溶解態(tài)Fe(Ⅱ)的濃度(mmol/L),其中C0=0.2 mmol/L。

由圖1可見，在不同pH值條件下，F(xiàn)e(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株活菌數(shù)量均大量減少。MnB1菌株的失活主要是由以下兩個機(jī)制引起的：①Fe(Ⅱ)活化O過程中生成的ROS通過損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成細(xì)菌失活；②Fe(Ⅱ)氧化生成的鐵(氫)氧化物沉淀包被在細(xì)胞表面，通過破壞細(xì)胞膜的通透性引起細(xì)菌失活。此外，由圖1(a)可見，不同pH值條件下MnB1菌株的失活速率存在顯著差異：當(dāng)pH值為7.0時，F(xiàn)e(Ⅱ)氧化5 min即使MnB1菌株活菌數(shù)量降低了4.3個數(shù)量級(lg)；而當(dāng)pH值為6.6時，反應(yīng)60 min時MnB1菌株活菌數(shù)量下降了4個數(shù)量級(lg)。由圖1(b)可見，pH值為7.0的實(shí)驗(yàn)體系中Fe(Ⅱ)的氧化速率遠(yuǎn)高于pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系，說明MnB1菌株的失活速率與Fe(Ⅱ)的氧化速率密切相關(guān)。另外，pH值為7.0的實(shí)驗(yàn)體系中反應(yīng)60 min時Fe(Ⅱ)幾乎全部被氧化，而pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系中反應(yīng)至60 min時僅有17%的Fe(Ⅱ)被氧化，此時pH值為7.0的實(shí)驗(yàn)體系中鐵(氫)氧化物的含量遠(yuǎn)高于pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系。然而，最終兩個實(shí)驗(yàn)體系中MnB1菌株的失活數(shù)量相差并不大，即單位Fe(Ⅱ)氧化量下pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系中MnB1菌株的失活率更高，這是由于pH值的降低能夠顯著促進(jìn)Fe(Ⅱ)氧化過程中羥基自由基(·OH)的產(chǎn)生，見圖2。

圖2 pH值對實(shí)驗(yàn)體系中·OH產(chǎn)生量的影響Fig.2 Effect of pH on ·OH production

由圖2可見，當(dāng)pH值由7.0降為6.6時，反應(yīng)60 min后實(shí)驗(yàn)體系中·OH的累積濃度由1.6 μmol/L增加至3.7 μmol/L，因此使得pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系中因·OH的產(chǎn)生造成失活的MnB1菌株數(shù)量更多。

2.2 天然有機(jī)質(zhì)對MnB1菌株失活的影響

在pH值為7.0的條件下，本實(shí)驗(yàn)考察了檸檬酸鈉、草酸和腐殖酸3種天然有機(jī)質(zhì)對MnB1菌株活性和溶解態(tài)Fe(Ⅱ)氧化的影響，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可見，3種有機(jī)質(zhì)均抑制了Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株的失活，且草酸和腐殖酸對Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株失活的抑制率遠(yuǎn)高于檸檬酸鈉；反應(yīng)60 min時，5～20 mg/L檸檬酸鈉對MnB1菌株失活的抑制率為16.6%～30.3%[見圖3(a)]，5～20 mg/L草酸對MnB1菌株失活的抑制率為 64.3%～68.7%[見圖3(b)],10～30 mg/L腐殖酸對MnB1菌株失活的抑制率為63.6%～73.4%[見圖3(c)]。

圖3 3種天然有機(jī)質(zhì)對MnB1菌株活性和溶解態(tài)Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.3 Change curves of MnB1 activity and Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under three different natural organic matters conditons

天然有機(jī)質(zhì)對Fe(Ⅱ)氧化過程中細(xì)菌的失活有兩種相反的作用:一方面，天然有機(jī)質(zhì)可通過與Fe(Ⅱ)發(fā)生配位絡(luò)合作用，從而促進(jìn)了Fe(Ⅱ)的氧化和ROS的產(chǎn)生，如加入10 mg/L檸檬酸鈉、10 mg/L草酸和10 mg/L腐殖酸反應(yīng)60 min后實(shí)驗(yàn)體系中·OH的累積濃度由1.6 μmol/L分別增加至1.7 μmol/L、2.3 μmol/L和3.5 μmol/L，該機(jī)制會促進(jìn)細(xì)菌的失活[見圖4(a)];另一方面，天然有機(jī)質(zhì)可能與Fe(Ⅲ)發(fā)生配位絡(luò)合作用，從而抑制鐵(氫)氧化物沉淀的生成，該機(jī)制會抑制Fe(Ⅱ)氧化過程中細(xì)菌的失活，即加入3種天然有機(jī)質(zhì)后促進(jìn)了反應(yīng)體系中水相Fe(Ⅲ)的產(chǎn)生，從而抑制了鐵(氫)氧化物沉淀的生成，且腐殖酸和草酸對鐵(氫)氧化物沉淀的抑制作用明顯高于檸檬酸。該研究結(jié)果表明，天然有機(jī)質(zhì)對鐵(氫)氧化物沉淀的抑制作用在本實(shí)驗(yàn)體系中占主導(dǎo)地位，由此導(dǎo)致了天然有機(jī)質(zhì)實(shí)驗(yàn)體系中MnB1菌株失活率的降低。

圖4 不同天然有機(jī)質(zhì)種類對·OH累積濃度、水相Fe(Ⅲ)濃度和固相Fe(Ⅲ)濃度的影響Fig.4 Effect of natural organic matters on the production of ·OH,aqueous Fe(Ⅲ) and solid Fe(Ⅲ)

2.3 陰陽離子對MnB1菌株失活的影響

圖5 不同P、Mg2+和Ca2+濃度對MnB1菌株活性和溶解態(tài)Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.5 Change curves of MnB1 activity and dissolved Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under different concentrations of P,Mg2+ and Ca2+

由圖5(b)、(c)可見，Mg、Ca的加入明顯抑制了Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株的失活，反應(yīng)60 min時，1 mmol/L、3 mmol/L和6 mmol/L的Mg對MnB1菌株失活的抑制率分別為52.7%、54.2%和70.2%，1 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L的Ca對MnB1菌株失活的抑制率分別為49.0%、53.8%和66.5%。Mg、Ca對Fe(Ⅱ)氧化過程中·OH的產(chǎn)生量無明顯影響。

Mg、Ca的加入使實(shí)驗(yàn)體系中的pH值由7.0最終降為6.6(見圖6)。由圖1(a)可知，當(dāng)pH值由7.0降為6.6，反應(yīng)60 min時，MnB1菌株的失活量僅緩解了約0.3個數(shù)量級(lg)，而加入Mg和Ca后實(shí)驗(yàn)體系中MnB1菌株的失活量被緩解了約2.5個數(shù)量級(lg)，遠(yuǎn)高于0.3個數(shù)量級(lg)，這表明實(shí)驗(yàn)體系pH值的降低只是Mg和Ca抑制MnB1菌株失活的次要因素。Cl與·OH的反應(yīng)常數(shù)達(dá)4.3×10[mol/(L·s)]，且有研究表明Cl因消耗反應(yīng)體系中的·OH進(jìn)而抑制了活性氧物質(zhì)對污染物的降解,因此Cl可通過競爭·OH進(jìn)而抑制MnB1菌株的失活，該過程是抑制MnB1菌株失活的主要因素。

圖6 Mg2+、Ca2+體系中pH值的變化Fig.6 pH variations in the presence of Mg2+ and Ca2+

2.4 環(huán)境意義

3 結(jié) 論

(1) pH值為7.0的實(shí)驗(yàn)體系通過促進(jìn)Fe(Ⅱ)的氧化速率提高了MnB1菌株的失活總量，但pH值為6.6的實(shí)驗(yàn)體系中由于促進(jìn)了·OH的產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致單位Fe(Ⅱ)氧化量下MnB1菌株的失活率更高。

(2) 檸檬酸鈉、草酸和腐殖酸均通過阻止鐵(氫)氧化物沉淀的生成來抑制實(shí)驗(yàn)體系中MnB1菌株的失活。其中，草酸和腐殖酸的抑制作用大于檸檬酸鈉，其原因?yàn)榍皟烧邔﹁F(氫)氧化物沉淀生成的抑制作用更強(qiáng)。