張 克，劉 瑤

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 贛州 341000）

癌癥是人類健康的主要威脅之一。全球癌癥的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018 年新增1 810 萬癌癥病例，960 萬死亡病例［1］。近年來，由于不良因素如吸煙、酗酒、腌制食品和缺乏運(yùn)動(dòng)等影響，癌癥的風(fēng)險(xiǎn)正在迅速增長(zhǎng)。

中性粒細(xì)胞是一種在外周血中所占比例最大的白細(xì)胞。它們具有趨化、吞噬、殺菌等功能。當(dāng)局部組織受到細(xì)菌等侵害時(shí)，中性粒細(xì)胞在趨化因子等作用下，穿越血管壁進(jìn)入炎癥組織，并大量聚集。這些細(xì)胞可吞噬和消化入侵病原體，構(gòu)成人體第一道免疫防線［2］。

一些研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在大量中性粒細(xì)胞。FADY C 等［3］發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的中性粒細(xì)胞可作為免疫細(xì)胞，具有潛在抗癌功能。而另一項(xiàng)研究表明，一些中性粒細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，這種雙重作用可能歸因于腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（Tumor associated neutrophil，TAN）的2種不同亞型：抗腫瘤型中性粒細(xì)胞（N1）和促腫瘤型中性粒細(xì)胞（N2）。具有抗腫瘤效應(yīng)的N1可通過釋放高水平的超氧化物和過氧化氫等誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，破壞腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤生長(zhǎng)［5］；N2中性粒細(xì)胞可通過釋放大量免疫調(diào)節(jié)因子，如精氨酸酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶9 等促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［6-7］。在這兩種腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)

胞中，N1的作用引起了研究人員的主要關(guān)注。最近研究發(fā)現(xiàn)，由N1 形成的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular traps，NETs）可能在抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中起關(guān)鍵作用。研究NETs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制可為癌癥提供新的治療靶標(biāo)。本文對(duì)NETs及它在癌癥中的作用進(jìn)行綜述。

1 NETs

1.1 NETs 簡(jiǎn)介2004年BRINKMANN V 等［8］首次發(fā)現(xiàn)一種由中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs 由直徑15～17 nm的平滑纖維和直徑25 nm 的球狀結(jié)構(gòu)組成，且外周無膜結(jié)構(gòu)包被。在細(xì)菌脂多糖、真菌、病毒和激活的血小板等作用下，中性粒細(xì)胞會(huì)向胞外釋放去聚化的DNA，并以此為骨架，鑲嵌多種蛋白，共同構(gòu)成NETs（見 圖1）［9］。這些蛋白主要包括組蛋白（Histones）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）、髓 過 氧 化 物 酶（Myeloperoxidase，MPO）、基質(zhì)金屬蛋白酶9、組織蛋白酶G（Cathepsin G，CG）等多種抗菌蛋白（見表1）［10］。

圖1 中性粒細(xì)胞和NETs

表1 NETs的構(gòu)成組分

在體內(nèi)，中性粒細(xì)胞形成NETs 有兩種模式：①自殺式NETs：中性粒細(xì)胞受到炎癥刺激，通過磷脂肌醇信號(hào)途徑（PKC）激活NADPH 氧化酶和Raf/MERK/ERK 信號(hào)通路，進(jìn)而刺激活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species,ROS）產(chǎn)生，在肽?；彼崦搧啺泵福≒eptidylarginine deiminase4，PAD4）誘導(dǎo)下，組蛋白瓜氨酸化（Citrullinated histone H3，H3Cit）導(dǎo)致核染色體解聚。此過程耗時(shí)2～4 h。②活體式NETs：中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核膜和細(xì)胞膜的完整性不被破壞，且不依賴于ROS 的產(chǎn)生和Raf/MERK/ERK信號(hào)通路的激活。此過程耗時(shí)5～60 min。Toll 樣受體、補(bǔ)體C3 蛋白可能是觸發(fā)此種類型的刺激因素，釋放NETS 后的中性粒細(xì)胞仍具有吞噬病原體的能力，且其壽命不受影響。

1.2 NETs 檢測(cè)方法目前，一般通過定性、定量檢測(cè)手段評(píng)估NETs 形成。定量方法有：①既往國內(nèi)外學(xué)者們通過PicoGreen 熒光分光光度法檢測(cè)血漿游離DNA（cf-DNA）來評(píng)判NETs 形成［11］，雖然PicoGreen 熒光染料法是一種靈敏的雙鏈DNA 檢測(cè)方式，通過檢測(cè)儀可檢測(cè)到pg 級(jí)的微量DNA，但這種檢測(cè)方法因不能排除其它形式細(xì)胞死亡產(chǎn)生的DNA 的干擾，所以不能精確評(píng)判NETs 的形成［12］；②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是近年來具有較高特異性、穩(wěn)定性的NETs定量檢測(cè)方法，一般是測(cè)量NETs來源蛋白（H3Cit、MPO、NE）和DNA 復(fù)合物［13-14］。定性方法有：①免疫印跡法通過比較NETs 標(biāo)志蛋白（H3Cit、MPO、NE）的相對(duì)表達(dá)水平來評(píng)價(jià)NETs 的生成；②免疫熒光激光共聚焦法通過分析DNA 和NETs 標(biāo)志蛋白（H3Cit、MPO、NE）共定位的熒光圖實(shí)現(xiàn)NETs 定性/半定量檢測(cè)，可直觀觀察到NETs 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是區(qū)分NETs 與細(xì)胞凋亡、壞死等機(jī)制的最可靠方法［15-17］。

2 NETs在腫瘤發(fā)病過程中的作用

2.1 NETs 與腫瘤發(fā)生在肺癌中，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞和細(xì)胞外染色質(zhì)積累形成NETs，會(huì)促進(jìn)肺癌發(fā)生［18］。有報(bào)告顯示，在原發(fā)性腫瘤和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)內(nèi)的切片中有大量NETs［19］。與正常對(duì)照組相比，荷瘤小鼠的血漿中產(chǎn)生NETs 更多［20］。腫瘤細(xì)胞通過分泌G-CSF、IL-8 等細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)NETs 形成［21］。在胰腺癌小鼠和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉患者的胰腺腫瘤中觀察到瓜氨酸化組蛋白表達(dá)，是NETs形成的標(biāo)志。自噬是胰腺癌細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子，吞噬受體dectin1 通過促進(jìn)吞噬體形成使NE遠(yuǎn)離細(xì)胞核，抑制NETs 形成［22］。晚期糖基化終產(chǎn)物（Receptor for advanced glycation end products，RAGE）受體介導(dǎo)胰腺腫瘤微環(huán)境的自噬，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。用氯喹抑制自噬或RAGE敲除術(shù)可降低瓜氨酸化組蛋白表達(dá)，降低胰腺腫瘤微環(huán)境下的NETs形成傾向［23］。因此，可推論NETs 在胰腺癌中是通過RAGE依賴/自噬途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 和組蛋白通過TLR4/9信號(hào)通路促進(jìn)NETs 生成［24-26］，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和粘附循環(huán)腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)結(jié)腸癌肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移病灶形成［27］。非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者血漿中MPO-DNA 含量明顯增高，在鏈脲佐菌素與高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH 模型的肝臟中可檢測(cè)到中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）水平增加，且棕櫚酸和亞油酸等FFA 可誘導(dǎo)NETs 形成，隨后伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子生成，最終導(dǎo)致肝癌［28］。

2.2 NETs與腫瘤轉(zhuǎn)移NETs可通過物理作用，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞錨定，有利于腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附。干擾這種相互作用，可以有效減少腫瘤細(xì)胞跨內(nèi)皮滲出和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，誘導(dǎo)NETs 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肺部及肝臟形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；而使用DNase 酶切割NETs 的DNA 骨架，或使用NE 抑制劑抑制NETs 形成，可顯著減少遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成。COOLS-LARTIGUE 等在盲腸結(jié)扎和穿刺的敗血癥肺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了大量NETs，與無感染對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，這種效應(yīng)可通過NETs 的降解酶DNaseI 來消除。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)A549 肺癌細(xì)胞在NETs存在下遷移和侵襲增加。循環(huán)中NETs可通過招募血小板保護(hù)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，為轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞提供了便利。

2.3 NETs 與腫瘤相關(guān)血栓腫瘤通過產(chǎn)生組織因子（Tissue factor，TF）促進(jìn)血小板活化，活化的血小板通過P-選擇蛋白直接結(jié)合中性粒細(xì)胞上的P-選擇素糖蛋白配體（PSGL-1），依賴TLR4 機(jī)制介導(dǎo)NETs 生成［29］。P-選擇蛋白能促進(jìn)PMN 中ROS 產(chǎn)生，這一過程對(duì)該選擇蛋白誘導(dǎo)NETs 有著十分關(guān)鍵的作用（Etulain2015）。P-選擇蛋白缺乏小鼠的血小板不能誘導(dǎo)NETs 形成，而P-選擇蛋白高表達(dá)的小鼠血小板與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)更容易誘導(dǎo)NETs 形成?；罨难“宕龠M(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒和吞噬作用，刺激中性粒細(xì)胞生成NETs，NETs 通過提供血小板粘附、活化和凝血酶生成的支架引發(fā)血栓形成［29］。ABDOL RAZAK 等發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞可快速誘導(dǎo)NETs 生成而不依賴于ROS 的產(chǎn)生，且血小板能促進(jìn)上述作用［30］。他們還進(jìn)一步評(píng)估了血小板在胰腺癌中誘導(dǎo)NETs 的作用，并觀察到胰腺癌細(xì)胞激發(fā)的血小板能使NETs釋放增多。

此外，NETs 在靜脈切斷應(yīng)激下促進(jìn)血栓形成，即PaCa 誘導(dǎo)的NETs 很大可能使PaCa 患者并發(fā)靜脈血栓栓塞，并可將NETs 視為潛在治療靶點(diǎn)。綜上所述，血小板與NETs 兩者相互影響，共同在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定作用。THOMAS 等利用深靜脈血栓（Deep venous thrombosis，DVT）小鼠模型，排除了腫瘤細(xì)胞衍生的腫瘤微粒體（microparticles，MPs）不需要P-選擇蛋白及血管性血友病因子（Von willebrand factor，VWF）來誘發(fā)DVT 發(fā)生。在靜態(tài)或流動(dòng)條件下，MPs 可在體外粘附在NETs 上，DNaseI 處理可防止MPs 粘附，而MPs 在其表面表達(dá)足夠的TF，可推斷，NETs 將MPs 引入病理性血栓形成部位［31］。因此，針對(duì)它們的招募或活性可提供策略來預(yù)防與癌癥相關(guān)的血栓并發(fā)癥發(fā)生。

3 針對(duì)NETs的腫瘤治療

①脫氧核糖核酸酶Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）是核酸內(nèi)切酶，能催化DNA 和雙鏈DNA降解。DNA 作為NETs 的骨架，DNase Ⅰ降解NETs已被用作多種實(shí)驗(yàn)。報(bào)道表明DNase Ⅰ已在臨床應(yīng)用于治療兒童和成人的囊性纖維化和膿胸［32］，目前無患者健康產(chǎn)生顯著影響的報(bào)道，這表明它作為一種藥物是安全的。②染色質(zhì)解聚的過程取決于組蛋白瓜氨酸化，而這一過程是由PAD4 調(diào)控，WANG 等設(shè)計(jì)了一種PAD4 抑制劑，不僅抑制腫瘤生長(zhǎng)，也抑制癌相關(guān)血栓形成［33］。③動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NETs 的形成能促進(jìn)肺和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成，使用DNase Ⅰ或NE 抑制劑，可顯著減少遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移瘤的形成［34］。④肝素長(zhǎng)期以來一直被用于臨床治療，其抗凝血作用可防止組蛋白介導(dǎo)的血小板聚集［35］，破壞NETs 穩(wěn)定性，可能是一種治療手段。⑤針對(duì)活化的血小板與NETs 形成的相互作用，干預(yù)P-選擇蛋白/PSGL-1可能是一種潛在的治療策略。

綜上所述，NETs可逮捕并殺滅病原微生物保護(hù)機(jī)體不受侵害，但在惡性疾病進(jìn)程中更傾向于產(chǎn)生負(fù)面影響，如血栓、術(shù)后轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)等。然而，目前仍然不清楚當(dāng)癌癥患者遭受感染風(fēng)險(xiǎn)后，NETS的抗感染作用和促癌作用哪個(gè)更重要。DNase Ⅰ或PAD4 抑制劑，成為阻斷NETs 形成的新治療靶點(diǎn)。這些抑制劑在遏制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的同時(shí)，是否還會(huì)減弱宿主抵御病原微生物的入侵能力，需要進(jìn)一步的研究。