美洲錦鳚抗凍蛋白的表達(dá)與特性分析

陳 瑩, 趙慶春, 吳 瓊, 胡 北, 許子華

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110000)

0 引言

【研究意義】我國高寒地域廣泛，涵蓋東北、西北、華北等，人體長時(shí)間暴露在低溫環(huán)境中極易導(dǎo)致寒冷損傷，急需增強(qiáng)抵御寒冷的能力和提高寒冷情況下的作業(yè)能力[1]?？箖龅鞍资且活惸芤种票L或抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、工業(yè)等領(lǐng)域，醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用主要集中在細(xì)胞及器官的超低溫保存方面，若能拓展至凍傷防治領(lǐng)域，將會(huì)是一大突破，對(duì)寒冷損傷的預(yù)防研究具有重大意義[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生活在低溫環(huán)境下的魚類為了適應(yīng)生存環(huán)境，在長期進(jìn)化中產(chǎn)生了一種能抑制冰晶生長或抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，即抗凍蛋白(antifreeze peoteins,AFPs)?？箖龅鞍鬃钤缭?969年由Devries在極區(qū)海魚血液中發(fā)現(xiàn)，目前已證明AFPs普遍存在于魚類、植物、昆蟲、細(xì)菌和真菌中[1-3]?？箖龅鞍啄茉诮Y(jié)冰或亞結(jié)冰條件下保護(hù)生物體不受傷害，海水的冰點(diǎn)大約在-1.8℃，由于導(dǎo)熱介質(zhì)的不同，海水中的溫度變化比陸地小。針對(duì)抗凍蛋白的作用機(jī)制研究，學(xué)者們提出了多種假說，大多數(shù)研究者比較接受Raymond在1977年提出的吸附抑制學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為在低溫條件下，AFPs具有選擇吸附性，首先結(jié)合在冰晶生長的表面，使冰晶停止生長，而未被AFPs覆蓋的區(qū)域晶體則沿著平面逐漸向前推進(jìn)，最終形成圓形的表面，使其表面曲率增加，進(jìn)而增加晶體表面積，從而影響晶體生長[4-8]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于仿生學(xué)原理，利用分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究美洲錦鳚抗凍蛋的表達(dá)與特性，為探索寒冷損傷防治的新方法奠定理論基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】美洲錦鳚體內(nèi)的抗凍蛋白為Ⅲ型抗凍蛋白，研究低溫誘導(dǎo)獲得可溶性AFPs的誘導(dǎo)條件，通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建美洲錦鳚抗凍蛋的低溫表達(dá)系統(tǒng)，研究魚類抗凍蛋白的特征特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 PMD18T-AFP質(zhì)粒、感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、BL21(DE3)均為中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 PCR擴(kuò)增試劑、限制性內(nèi)切酶Xho I、Nde I，T4 DNA連接酶，Taq酶以及DL2000 DNA marker等購自寶生物工程(大連)公司，異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp+)、超低分子量蛋白marker、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮藍(lán)快速染色液均購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建表達(dá)載體 設(shè)計(jì)引物：F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，R: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。通過PCR從PMD18T-His6-AFP質(zhì)粒上獲取目的基因，利用Xho Ⅰ、VNdeⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，得到的酶切片段用T4 DNA連接酶與pET22b載體連接，使目的基因克隆至pET-22b載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)。通過菌落PCR鑒定，擴(kuò)增所得的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出陽性克隆的單菌落，并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌株接種至含Amp+的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，考察不同誘導(dǎo)溫度(18℃，28℃，37℃)及不同終濃度誘導(dǎo)劑(IPTG)(0 mmol/L, 0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.4 mmol/L)對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響，優(yōu)化誘導(dǎo)條件。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除培養(yǎng)基，收集菌體，超聲破碎后離心，吸取上清液，得到可溶性蛋白，通過 Elisa分析蛋白表達(dá)情況，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.3 蛋白純化 經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后收集菌體，超聲破碎的上清液通過Chelating Sepharose Fast Flow層析對(duì)含有His-tag的目的蛋白進(jìn)行純化，將樣品以0.8 mL/min的流速上樣，再用含不同濃度咪唑的緩沖液洗脫，收集不同條件下的洗脫液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定 從Tricine-SDS-PAGE分析的膠條上切取目的蛋白，經(jīng)處理后通過MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，采用自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)及正離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，將一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合，并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.3(Matrix Science)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析和蛋白鑒定。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 從基因數(shù)據(jù)庫(GenBank/EMBL)中獲取各種魚類抗凍蛋白的序列信息，用MEGA 7.0 進(jìn)行多序列比對(duì)，用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 性質(zhì)分析 根據(jù)結(jié)構(gòu)、活性、作用機(jī)制等的差異，對(duì)幾種魚類抗凍蛋白的性質(zhì)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

培養(yǎng)后的菌落通過PCR鑒定(圖1)，篩選出的陽性單菌落序列與GeneBank中魚類抗凍蛋白的序列比對(duì)一致。

注：M為DNA marker，1～5為AFP的PCR產(chǎn)物。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)

從圖2看出，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)溫度為18℃時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高。

圖2 不同誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑不同濃度處理目的蛋白的表達(dá)量

2.3 蛋白分離純化

電泳結(jié)果(圖3)顯示，最終純化的蛋白僅有1條清晰條帶，說明目的蛋白基本達(dá)到電泳純。

注：M為Protein ladder，1為菌體裂解液，2為穿過液，3為洗滌液，4為低濃度咪唑洗脫液，5為高濃度咪唑洗脫液。

2.4 質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)鑒定

通過 MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定，有效地優(yōu)化了誘導(dǎo)條件，通過GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.3(Matrix Science)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析和蛋白鑒定結(jié)果顯示(圖4)，目的蛋白為美洲錦鳚抗凍蛋白。

圖4 重組AFP的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.5 生物信息學(xué)

從圖5可知，美洲錦鳚AFP與大西洋狼魚(Anarhichaslupus)、大西洋鯡(Clupeaharengus)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等魚類的親緣關(guān)系較近，與其他魚類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 魚類AFP氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 魚類幾種抗凍蛋白的性質(zhì)

從表1和圖6看出，在魚類幾種抗凍蛋白中分子量最小的是AFPⅠ，其富含丙氨酸，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，由α螺旋組成，主要與冰晶表面的錐面或二級(jí)棱面結(jié)合。AFP II分為2種亞型，Ca2+依賴亞型與Ca2+不依賴亞型，其中Ca2+有助于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的穩(wěn)定，分子中所含的半胱氨酸形成幾對(duì)二硫鍵，整個(gè)結(jié)構(gòu)中包括多個(gè)α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲，其主要通過錐面或二級(jí)棱面與冰晶表面結(jié)合。作為球狀蛋白的AFP III，主要由多個(gè)β折疊組成，與冰晶的錐面和棱面發(fā)生相互作用。AFGP富含糖基，由三糖肽(-Ala-Ala-Thr-)串聯(lián)而成，可分為8種亞型，AFGP1亞型分子量最大，而AFPG8亞型分子量最小，主要與冰晶的棱面相結(jié)合。HAFP是最后一類發(fā)現(xiàn)的魚類抗凍蛋白，由相同亞基組成同源二聚體，空間結(jié)構(gòu)呈四螺旋捆，通過錨定機(jī)制與冰晶結(jié)合[8-11]。

表1 魚類幾種抗凍蛋白的性質(zhì)

圖6 魚類幾種抗凍蛋白的構(gòu)象

3 討論

目前，抗凍蛋白的基因工程表達(dá)大多是利用原核表達(dá)體系。對(duì)IPTG誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果表明，不同誘導(dǎo)溫度和終濃度誘導(dǎo)劑(IPTG)對(duì)表達(dá)效率有影響，重組美洲錦鳚抗凍蛋白在18℃及0.1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)條件下表達(dá)水平更高。表明，較低的溫度降低了蛋白質(zhì)折疊速率，低濃度的IPTG降低了表達(dá)速率，盡可能避免了包涵體的生成，產(chǎn)生的可溶性蛋白更利于分離純化[12-14]。此外，作為小分子蛋白質(zhì)的AFP宜采用Tricine-SDS-PAGE進(jìn)行分析，以彌補(bǔ)普通SDS-PAGE對(duì)較低分子量的蛋白質(zhì)分辨率不高的缺點(diǎn)。當(dāng)較大的冰晶以小冰晶為單位逐漸生長時(shí)，就會(huì)形成重結(jié)晶，造成組織的物理損傷，這種現(xiàn)象是造成細(xì)胞損傷的主要原因。通過與冰晶結(jié)合，抑制其生長和變形，并控制及阻斷重結(jié)晶過程，有效減少細(xì)胞和組織的損傷[15-19]。

抗凍蛋白是一種高效的生物活性物質(zhì)，因具有特殊的熱滯活性已被廣泛地應(yīng)用在相關(guān)的農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域，其在冷凍食品工業(yè)中發(fā)揮著很好的保鮮作用，BINDSLEV-JENSEN等[20]曾經(jīng)對(duì)抗凍蛋白的致敏性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其與已知的過敏源沒有同源性，且在加入抗凍蛋白之后無組胺釋放，表明抗凍蛋白無致敏性，是一種比較安全的食品添加劑，應(yīng)用價(jià)值潛力巨大。

4 結(jié)論

研究成功構(gòu)建了美洲錦鳚抗凍蛋白的低溫表達(dá)系統(tǒng)，通過生物信息學(xué)分析，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。美洲錦鳚抗凍蛋白誘導(dǎo)的最佳溫度為18℃，IPTG加入終濃度為0.1mmol/L。美洲錦鳚AFP與大西洋狼魚(Anarhichaslupus)、大西洋鯡(Clupeaharengus)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等魚類的親緣關(guān)系較近，而與其他魚類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。