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    糖分子探針與炎癥因子、Claudin-8在結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關(guān)性*

    2016-12-02 08:07:55王震凱王少東路又可汪芳裕
    胃腸病學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:通透性甘露醇結(jié)腸炎

    施 慧 王震凱 王少東 路又可 汪芳?!?/p>

    南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科1 (210002) 南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院2

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    糖分子探針與炎癥因子、Claudin-8在結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關(guān)性*

    施 慧1,2#王震凱1王少東1路又可1汪芳裕1▲

    南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科1(210002) 南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院2

    背景:腸黏膜通透性改變是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。糖分子探針是檢測(cè)通透性的一種安全無(wú)創(chuàng)的方法,其與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關(guān)性尚不明確。目的:探討糖分子探針與TNF-α、CRP和claudin-8在結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關(guān)性。方法: 24只大鼠隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組,以DSS溶液制備結(jié)腸炎模型。ELISA法檢測(cè)TNF-α、CRP表達(dá),免疫組化法檢測(cè)claudin-8表達(dá),高效液相色譜儀檢測(cè)糖分子探針含量,分析炎癥因子、claudin-8與糖分子探針的相關(guān)性。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,模型組結(jié)腸組織TNF-α、CRP表達(dá)顯著升高(P<0.01);claudin-8表達(dá)顯著降低(P<0.01);乳果糖和三氯蔗糖排出量以及乳果糖/甘露醇比值明顯升高(P<0.01),甘露醇排出量明顯降低(P<0.01)。乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01),與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);而乳果糖/甘露醇比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論:糖分子探針與TNF-α、CRP以及claudin-8表達(dá)在提示大鼠腸黏膜通透性改變上的結(jié)果一致。糖分子探針可作為一種反映腸黏膜通透性改變的潛在檢測(cè)方法。

    通透性; 分子探針; 腫瘤壞死因子α; C反應(yīng)蛋白質(zhì); claudin-8; 結(jié)腸炎, 潰瘍性

    Colitis, Ulcerative

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種腸道慢性炎癥性疾病,腸黏膜屏障功能損傷是UC發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。TNF-α在UC患者結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞表面均有表達(dá),血清TNF-α水平與反映疾病活動(dòng)度的臨床和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)密切相關(guān)。CRP在炎癥性腸病與腸道功能性疾病的鑒別診斷中起重要作用,UC患者血清CRP含量明顯升高,與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),可作為檢測(cè)UC病情進(jìn)展的重要參數(shù)。Claudin是一種四次跨膜的結(jié)構(gòu)蛋白,是細(xì)胞間隙通透性的重要調(diào)節(jié)因子。UC活動(dòng)期結(jié)腸上皮細(xì)胞claudin-8亞型與上皮細(xì)胞間隙通透性有密切的關(guān)系。糖分子探針通過(guò)口服一定劑量的糖,檢測(cè)糖在代謝過(guò)程中的消耗量來(lái)評(píng)估胃腸道吸收情況,從而間接反映胃腸黏膜受損情況,特定糖的吸收部位有所不同,故可根據(jù)糖的種類確定受損部位。目前糖分子探針與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關(guān)性尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)大鼠尿液中糖分子探針含量,旨在對(duì)其與炎癥因子、claudin-8在UC腸黏膜通透性中的相關(guān)性作一分析。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

    健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,3月齡,體質(zhì)量(200±20) g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)鼠籠中,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

    二、研究方法

    1. 模型制備:SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和模型組,每組各12只,正常對(duì)照組大鼠自由飲水進(jìn)食,模型組大鼠自由飲用DSS溶液7 d,建立結(jié)腸炎模型。每日測(cè)定大鼠體質(zhì)量,糞便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性甚至出現(xiàn)肉眼血便,表示造模成功。

    2. 取材和標(biāo)本處理:造模成功后,采取灌胃法分別口服2 mL 0.06 g/mL乳果糖、0.04 g/mL甘露醇、0.03 g/mL三氯蔗糖。10%的麝香草酚加入異丙醇配制成100 mL溶液,以阻止細(xì)菌降解尿糖。大鼠禁水3 h。收集24 h尿液。麻醉后處死大鼠,取結(jié)腸遠(yuǎn)端長(zhǎng)約0.5 cm的組織,置于4%甲醛溶液中固定,用于HE染色和免疫組化染色。其余結(jié)腸組織-20 ℃保存,用于檢測(cè)TNF-α和CRP水平。

    3. ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α、CRP水平:將結(jié)腸組織配制成勻漿液后離心,經(jīng)稀釋、加樣、洗滌、孵育后測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處的A值。BCA法定量,用上清液蛋白含量對(duì)樣品中炎癥因子含量進(jìn)行再校正。

    4. 免疫組化法檢測(cè)claudin-8表達(dá):取各組大鼠結(jié)腸組織切片,按試劑盒說(shuō)明書(shū)行免疫組化二步法(一抗和二抗的工作濃度分別為 1∶100 和 1∶10)。

    結(jié)果判斷:細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙呈棕黃色為claudin-8陽(yáng)性表達(dá)。用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析,隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野,高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,參照王娟等[1]的研究方法,半定量計(jì)算claudin-8陽(yáng)性表達(dá)。

    5. HPLC法:尿樣、標(biāo)準(zhǔn)樣置于氮?dú)猸h(huán)境中,75 ℃溫箱干燥。冷卻后每管加100 μL肟化液,75 ℃溫箱放置30 min。冷卻后每管加100 μL N-3甲基硅烷咪唑,75 ℃溫箱放置15 min,冷卻。采用HPLC檢測(cè)尿液中乳果糖、甘露醇、三氯蔗糖含量,計(jì)算乳果糖/甘露醇(L/M)比值,具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    其中,HU(Hounsfield Unit)為三維空間中每個(gè)單元對(duì)于二維圖像的CT值,ρa(bǔ)sh為灰度密度值,E為相應(yīng)位置單元材料的彈性模量,單位為MPa。通過(guò)Mimics材料賦值模塊,完成骨骼網(wǎng)格模型的非均勻單元賦值。

    結(jié) 果

    一、HE染色

    正常對(duì)照組黏膜上皮完整,細(xì)胞形態(tài)正常,杯狀細(xì)胞可見(jiàn),腺體排列整齊,黏膜下層、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)清晰。模型組黏膜上皮壞死脫落,上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞減少,隱窩破壞;炎癥滲出,典型潰瘍形成,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為主,可見(jiàn)出血性壞死(圖1)。表明成功制備結(jié)腸炎模型。

    A:正常對(duì)照組;B:模型組

    二、炎癥因子水平

    與正常對(duì)照組相比,模型組結(jié)腸組織TNF-α[(8.51±1.55) pg/mg對(duì)(2.21±0.38) pg/mg,P<0.01]、CRP[(161.80±35.60) ng/mg對(duì)(50.50±5.90) ng/mg,P<0.01]表達(dá)均顯著升高。

    三、免疫組化染色

    模型組claudin-8陽(yáng)性表達(dá)主要定位于上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙,正常對(duì)照組claudin-8表達(dá)較低,可見(jiàn)上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞少量表達(dá)(圖2);模型組claudin-8表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(0.100±0.007對(duì)0.200±0.011,P<0.01)。

    A:正常對(duì)照組;B:模型組

    四、分子探針含量

    與正常對(duì)照組相比,模型組乳果糖排出量、三氯蔗糖排出量明顯升高(P<0.01),L/M比值明顯升高(17.55±5.02對(duì)0.80±0.69,P<0.01),甘露醇排出量顯著降低(P<0.01)(圖3)。

    五、相關(guān)性分析

    乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01),與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);L/M 比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。

    圖3 兩組大鼠糖分子探針排出量比較(HPLC法)

    討 論

    目前研究認(rèn)為UC的發(fā)病機(jī)制可能與環(huán)境、遺傳、免疫等因素共同作用所致的腸黏膜屏障功能損傷有關(guān)[2]。腸黏膜通透性改變可能是發(fā)病的基礎(chǔ)。

    腸黏膜局部炎癥反應(yīng)是UC發(fā)生、發(fā)展的主要病理機(jī)制,與一系列細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)有關(guān)。TNF-α是一種前炎癥因子,主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和分化的T細(xì)胞分泌,可刺激免疫細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6,上調(diào)黏附分子和促凝血因子的表達(dá),引發(fā)細(xì)胞毒性急性反應(yīng)[3]。Olsen等[4]發(fā)現(xiàn),組織TNF-α水平與局部炎癥反應(yīng)的分級(jí)呈正相關(guān)。有研究[5]發(fā)現(xiàn)claudin-8在結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)降低,導(dǎo)致緊密連接中斷,提示claudin-8可能與UC的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為,UC患者的CRP與臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡下表現(xiàn)以及組織學(xué)表現(xiàn)有較好的相關(guān)性[6-7];CRP亦可提示UC患者內(nèi)鏡下腸道表現(xiàn)[8]。

    糖分子探針可對(duì)尿液中的糖進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需取血,是目前公認(rèn)的檢測(cè)胃腸黏膜損傷的無(wú)創(chuàng)性方法[9]。目前有三類糖分子探針:第一類糖探針在離開(kāi)胃時(shí)就已完全被破壞,如蔗糖,用于檢測(cè)上胃腸道黏膜通透性;第二類糖探針在離開(kāi)小腸時(shí)就已完全被破壞,如乳果糖、甘露醇,用于檢測(cè)小腸黏膜通透性;第三類糖探針全程均不降解,如三氯蔗糖,用于檢測(cè)全消化道黏膜通透性[10]。乳果糖和甘露醇在腸道內(nèi)的吸收途徑不同[11],乳果糖分子質(zhì)量為342 kDa (1 Da=0.992 1 u),通過(guò)小腸黏膜上皮細(xì)胞間的靜脈連接吸收;甘露醇分子質(zhì)量為182 kDa,通過(guò)小腸上皮細(xì)胞膜的水溶性微孔吸收。進(jìn)入血液循環(huán)后兩者均不易代謝,最終從尿液中排出,因此可通過(guò)定量尿液中兩者的含量,反應(yīng)其吸收量。尿液中L/M比值升高,表明上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,如腸黏膜緊密連接破壞,區(qū)域性腸上皮細(xì)胞缺失或絨毛末梢損傷,并因此造成黏膜通透性增加,組織間隙水腫。故測(cè)定尿液中L/M比值可較為準(zhǔn)確地反映腸黏膜通透性的改變[12]。

    結(jié)合多種檢測(cè)方法可較為準(zhǔn)確地反映腸黏膜的改變。目前臨床上主要通過(guò)結(jié)腸鏡觀察黏膜的潰瘍性改變,并通過(guò)取活檢觀察黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)了解腸道損傷情況,有時(shí)還需進(jìn)一步采取免疫組化檢測(cè)炎癥因子來(lái)了解腸黏膜損傷情況,但這些檢測(cè)耗時(shí)且費(fèi)用不低。而糖分子探針是一種更為簡(jiǎn)單易行、創(chuàng)傷小、費(fèi)用低、安全可靠的檢測(cè)方法。本研究首先成功構(gòu)建了結(jié)腸炎大鼠模型,再分別利用結(jié)腸組織TNF-α、CRP、claudin-8表達(dá)以及糖分子探針檢測(cè)大鼠腸道通透性的改變。結(jié)果顯示模型組大鼠表現(xiàn)為典型的結(jié)腸炎改變,黏膜上皮壞死脫落,炎癥滲出,典型潰瘍形成,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)出血性壞死。L/M比值和三氯蔗糖排出量明顯改變,提示結(jié)腸炎時(shí)腸黏膜通透性發(fā)生改變。且模型組TNF-α、CRP表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組,說(shuō)明結(jié)腸炎時(shí)腸道發(fā)生炎癥性改變,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4-5,13];緊密連接蛋白claudin-8表達(dá)明顯降低,提示腸黏膜通透性發(fā)生改變。上述結(jié)果與糖分子探針一致,共同反映了腸黏膜的炎癥損害。相關(guān)性分析顯示乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān),與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān);而L/M比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)。

    綜上所述,糖分子探針與TNF-α、CRP、claudin-8表達(dá)在提示大鼠腸黏膜通透性改變上具有一致性。有望作為臨床上檢測(cè)腸黏膜通透性的無(wú)創(chuàng)方法,具有較好的臨床使用前景。

    1 王娟, 賈立群, 譚煌英, 等. 生姜瀉心湯對(duì)伊立替康化療后大鼠腸黏膜損傷修復(fù)的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 35 (10): 1236-1243.

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    11 Vilela EG, Torres HO, Ferrari ML, et al. Gut permeability to lactulose and mannitol differs in treated Crohn’s disease and celiac disease patients and healthy subjects[J]. Braz J Med Biol Res, 2008, 41 (12): 1105-1109.

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    13 Singh UP, Singh NP, Murphy EA, et al. Chemokine and cytokine levels in inflammatory bowel disease patients[J]. Cytokine, 2016, 77: 44-49.

    (2016-03-08收稿;2016-04-03修回)

    Correlation of Sugar Molecular Probes with Inflammatory Factors and Claudin-8 in Intestinal Permeability in Colitis Rats

    SHIHui1,2,WANGZhenkai1,WANGShaodong1,LUYouke1,WANGFangyu1.

    1DepartmentofGastroenterologyandHepatology,JinlingHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing(210002);2SouthernMedicalUniversity,SchoolofMedicine,Guangzhou

    WANG Fangyu, Email: wangfy65@nju.edu.cn

    Permeability; Molecular Probes; Tumor Necrosis Factor-alpha; C-Reactive Protein; Claudin-8;

    10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.006

    南京軍區(qū)南京總醫(yī)院青年課題基金(批準(zhǔn)號(hào):2008021)、中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助(201150M1575)、中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助(2012T50895)

    #Email: 32767572@qq.com

    ▲本文通信作者, Email: wangfy65@nju.edu.cn

    Background: Intestinal permeability plays an important role in the development of ulcerative colitis. Sugar molecular probes is a safe and non-invasive method to measure intestinal permeability, and its correlation with inflammatory factors and claudin-8 is not clear. Aims: To explore the correlation of sugar molecular probes with TNF-α, CRP and claudin-8 in intestinal permeability in colitis rats. Methods: Twenty-four rats were assigned randomly to model group and normal control group. Colitis model was induced by DSS solution. Expressions of TNF-α, CRP were determined by ELISA, and expression of claudin-8 was determined by immunohistochemistry. Sugar molecular probes were determined by high performance liquid chromatography. Correlations of inflammatory factors and claudin-8 with sugar molecular probes were analyzed. Results: Compared with normal control group, expressions of colonic tissue TNF-α and CRP were significantly increased while expression of claudin-8 was significantly decreased in model group (P<0.01); secretion of lactulose and sucrolose, ratio of lactulose/mannitol (L/M) were significantly increased (P<0.01) while mannitol secretion was significantly decreased (P<0.01). Secretion of lactulose and sucrolose were positively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but negatively with expression of claudin-8 (P<0.01). L/M ratio and mannitol secretion were negatively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but positively with expression of claudin-8 (P<0.01). Conclusions: Sugar molecular probes and expressions of TNF-α, CRP, claudin-8 have similar results in predicting intestinal permeability in rats. Sugar molecular probes can be used as a potential method to measure intestinal permeability.

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