蕎麥蜂花粉多糖對(duì)人體糞便菌群代謝的影響

李 娟，鄧澤元，范亞葦

（南昌大學(xué) 南昌330047）

蕎麥蜂花粉是蜜蜂從蕎麥花藥中采集花粉，經(jīng)儲(chǔ)存和發(fā)酵形成的花粉團(tuán)，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，被稱為“微型營養(yǎng)庫”，多糖是其重要的組成部分之一。天然來源的多糖作為一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、調(diào)節(jié)胃腸等多種作用[1-2]。近年來，已有對(duì)蕎麥蜂花粉多糖的抗氧化，提高免疫，降血脂等活性功能的研究[3-4]，而未見對(duì)蕎麥蜂花粉多糖的體外發(fā)酵行為及對(duì)腸道菌群的影響報(bào)道。腸道菌群是定值在人體胃、腸道微生物的總稱，約有1 000 多種，數(shù)量達(dá)1013～1014，是人體體細(xì)胞數(shù)量的10 多倍[5]。最近研究表明，腸道菌群不僅具有調(diào)節(jié)腸道功能、促進(jìn)消化吸收、提高免疫力等被人熟知的作用，還具有調(diào)節(jié)腦-腸影響宿主的腦功能和行為能力等作用[6-8]。由于人體缺乏碳水化合物活性酶，大多數(shù)非消化性多糖不能被人體消化吸收，因此主要通過腸道微生物群落發(fā)酵來發(fā)揮生理活性作用[9]。人體新鮮糞便中的菌群種類及組成與人體腸道內(nèi)的菌群較為相似，可通過研究多糖在糞便菌群的發(fā)酵行為來表征腸道菌群。目前對(duì)于多糖對(duì)腸道菌群作用的研究多采用體外發(fā)酵模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，體外發(fā)酵試驗(yàn)更為經(jīng)濟(jì)且易控制試驗(yàn)參數(shù)，并可多次重復(fù)試驗(yàn)，是研究不同化合物與腸道菌群相互作用的重要工具[10]。

多糖的對(duì)人體腸道菌群的作用與其酵解后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，尤其是酵解過程中短鏈脂肪酸的組成情況[11]。多糖在腸道內(nèi)被菌群酵解產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸（SCFAs）可作為腸道上皮細(xì)胞的能量來源，保護(hù)腸道黏膜[12]，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等功能[13]。同時(shí)短鏈脂肪酸的生成會(huì)降低環(huán)境中pH 值，形成酸性環(huán)境，維持電解質(zhì)平衡，促進(jìn)有益菌的生長[14]。通過分析多糖酵解過程的代謝行為及代謝產(chǎn)物，可反映多糖對(duì)腸道菌群的影響。本研究通過建立體外發(fā)酵模型，分析不同濃度蕎麥蜂花粉多糖對(duì)人體糞便微生物菌群代謝產(chǎn)物的影響，探究蕎麥蜂花粉多糖的益生元作用，為今后蕎麥蜂花粉多糖與腸道菌群的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥蜂花粉，購自山西蜂農(nóng)；苯酚、水楊酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉，大茂化工試劑廠；次氯酸鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；偏磷酸，上海振興化工一廠；菊糖（分析純級(jí)）、短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸）系列標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司。發(fā)酵培養(yǎng)液中各試劑均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Bio-Tek 酶標(biāo)儀，美國伯騰有限公司；Agilent68990N 氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥蜂花粉多糖的制備 稱取適量破碎完全的蕎麥蜂花粉，置于50℃、90%乙醇溶液中回流脫脂1 h，自然晾干后于90℃去離子水中浸提4 h，離心取上清液，減壓濃縮后加入4 倍體積無水乙醇醇沉。采用木瓜蛋白酶-Sevag 法除蛋白，透析、冷凍干燥即得蕎麥蜂花粉多糖，命名為WFPP。采用苯酚-硫酸法測定中性糖含量，間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。

1.3.2 多糖單糖組成分析 參照文獻(xiàn)[15]方法測定蕎麥蜂花粉多糖單糖組成，WFPP 經(jīng)三氟乙酸溶液水解為多糖，之后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行糖精乙酸酯衍生處理，衍生物用氣相色譜分析。

1.3.3 多糖體外發(fā)酵

1.3.3.1 培養(yǎng)基配制 按文獻(xiàn)[16]方法分別配制微量培養(yǎng)液和衡量緩沖液，2 種溶液按體積比1∶100 的比例混合，即發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.3.3.2 體外酵解收集3 名志愿者的新鮮糞便（志愿者無胃、腸道疾病且至少3 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素），分別從志愿者糞便中取等量糞便混合，按固液比1∶5 加入發(fā)酵培養(yǎng)液，均質(zhì)化后用4 層無菌紗布過濾，收集濾液即人體糞便接種物，備用。

將蕎麥蜂花粉多糖及菊糖按一定比例分別加入發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行體外發(fā)酵。對(duì)于測試的樣品，最終的酵解體系組成為50%酵解培養(yǎng)基，50%人體糞便液，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至厭氧密封管中，在厭氧體系中（80%N2、10%CO2、10%H2）37℃酵解培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)分為5 組，以不添加多糖為空白對(duì)照組（CK 組），以菊糖為陽性對(duì)照組（菊糖組），培養(yǎng)液中菊糖含量為2.5%；多糖組分為低、中、高3 個(gè)水平（WFPP-L 組、WFPP-M 組、WFPP-H 組），各組培養(yǎng)液中糖含量分別為2.5%，5%，10%。

1.3.4 發(fā)酵液中pH 值的測定 在酵解0，6，12，18，24，36，48 h 時(shí)收集樣品發(fā)酵產(chǎn)物，迅速浸入冰水中停止發(fā)酵。離心后取上清液即發(fā)酵液，用精密pH 儀測定其pH 值。

1.3.5 總糖消耗率的計(jì)算取1.3.4 節(jié)收集的發(fā)酵液，采用苯酚-硫酸法[17]測定其總糖含量，計(jì)算發(fā)酵過程中多糖消耗率。

1.3.6 發(fā)酵液中NH3-N 含量的測定 發(fā)酵液中NH3-N 含量計(jì)算參照胡偉蓮[18]的方法，采用水楊酸-次氯酸鈉比色法測定發(fā)酵產(chǎn)物中NH3-N 含量。稱取適量氯化銨溶于鹽酸，配制系列濃度的氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品處理后于波長700 nm 處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中NH3-N 含量。

1.3.7 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量的測定 采用氣相色譜法[19]測定發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的含量。取離心后的發(fā)酵液，按體積比4∶1 加入25%偏磷酸，渦旋混勻后離心，取上清液，待測。

色譜條件：Agilent68990N 氣相色譜儀，F(xiàn)FAP柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），F(xiàn)ID 檢測器。升溫程序：設(shè)置初始柱溫100℃，保持1 min，然后以4℃/min 升至180℃，之后以20℃/min 升至200℃，維持5 min。設(shè)置檢測器和進(jìn)樣口溫度分別為240℃和200℃，載氣、燃?xì)夥謩e為N2、H2。N2、H2及空氣流速分別為2，30，300 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。通過樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比來計(jì)算脂肪酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的單糖組成

蕎麥蜂花粉經(jīng)脫脂、水提醇沉、除蛋白、透析、凍干等處理，得到其多糖WFPP，得率為4.31%。測得其中性糖含量為59.48%、糖醛酸含量11.0%，蛋白含量1.31%，水分含量9.15%。

WFPP 單糖氣相色譜圖及各單糖組成情況見圖1和表1。WFPP 主要由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal 等單糖組成，它們物質(zhì)的量比為2.84∶34.57∶1.69∶1.12∶27.11∶30.84。WFPP 主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖單糖組成，3 種單糖總含量達(dá)92.52%，含有少量的鼠李糖、木糖、甘露糖。其中阿拉伯糖與半乳糖的比例約為1∶1，推測WFPP由阿拉伯半乳聚糖。碘-碘化鉀試驗(yàn)為陰性，提取的多糖中無淀粉組分，同時(shí)WFPP 中葡萄糖含量較高，表明WFPP 中含有葡聚糖。由此可推測WFPP 主要由阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖組成，這與從大利[20]的研究結(jié)果一致。

圖1 WFPP 單糖氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of WFPP monosaccharides

表1 WFPP 單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of WFPP

2.2 發(fā)酵液pH 值的變化

pH 值是反映多糖在酵解過程中被人體腸道菌群利用程度的重要指標(biāo)[21]。如圖2所示，除空白組外，其它4 組發(fā)酵液pH 值隨發(fā)酵時(shí)間的延長而降低，pH 值變化主要發(fā)生在發(fā)酵前18 h 內(nèi)。酵解48 h 后，CK 組的pH 值從最初的7.49 降到7.33，無明顯變化；菊糖組pH 值降至6.12；WFPPL、WFPP-M 和WFPP-H 組pH 值分別降低至5.73，5.3，4.64，相較CK 組和菊糖組，發(fā)酵前、后多糖組pH 值顯著降低。整個(gè)發(fā)酵過程中，蕎麥蜂花粉多糖培養(yǎng)物中的pH 值始終低于空白組及陽性對(duì)照組，發(fā)酵18 h 時(shí)WFPP-H 組發(fā)酵液pH 值已降至4.54，且WFPP 添加量越大，發(fā)酵液pH 值降幅越明顯。陳春[22]發(fā)現(xiàn)桑葚多糖在體外酵解過程中隨著酵解時(shí)間的延長培養(yǎng)物中pH 值降低，與本研究結(jié)果一致。酵解過程中多糖被腸道中雙歧桿菌等菌群利用產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，降低培養(yǎng)液pH 值，同時(shí)環(huán)境中pH 值的變化也影響短鏈脂肪酸的生成和腸道微生物組成[23]。腸道pH 值的降低會(huì)使腸道形成一個(gè)酸性環(huán)境，抑制有害菌的繁殖，促進(jìn)有益菌的生長。另一方面pH 值也影響腸道微生物的酶活性，對(duì)人體腸道健康具有積極作用。

圖2 體外發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化Fig.2 The change of pH values of fermentation broth during in vitro fermentation

2.3 發(fā)酵液中總糖消耗率的變化

整個(gè)發(fā)酵過程中，各組發(fā)酵液中總糖含量均不同程度降低。尤其在發(fā)酵0～18 h 期間，總糖含量下降趨勢最為明顯。相較菊糖組，WFPP 主要在0～6 h 被消耗，發(fā)酵6 h 后WFPP 組總糖消耗率達(dá)50%，發(fā)酵18 h 后，WFPP-L、WFPP-M 及WFPPH 各組糖質(zhì)量濃度分別為0.29，0.41，0.56 mg/mL，此時(shí)發(fā)酵液中糖含量較低，與空白組0.27 mg/mL相似，WFPP 基本被腸道菌群消耗。菊糖主要在6～12 h 被微生物降解利用，發(fā)酵6 h 后菊糖中總糖消耗量僅增加14.22%，酵解12 h 后，消耗率為69.18%。發(fā)酵24 h，發(fā)酵液中WFPP 基本被消耗，在發(fā)酵24～48 h 期間糖含量無顯著變化，表明人體糞便腸道菌群主要在發(fā)酵前期酵解蕎麥蜂花粉多糖，在培養(yǎng)液中添加不同劑量的蕎麥蜂花粉多糖，均能被菌群較好的消化利用。

不同碳水化合物的降解程度及被腸道菌群的消耗速率存在差異，原因可能與多糖的組成及理化性質(zhì)有關(guān)，如單糖組成、聚合度、側(cè)鏈分布及空間構(gòu)像等，多糖的溶解度、黏度也會(huì)影響多糖被糞便菌群酵解的效果[24]。有文獻(xiàn)報(bào)道，某些膳食纖維、菊糖在體外發(fā)酵24 h 后，90%以上能被糞便菌群消耗掉，而麥芽糊在酵解過程中利用率低于50%[25]。車前子多糖在酵解24 h 后碳水化合物消耗量為47.2%，相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)豌豆纖維僅有20%被腸道菌群酵解利用[26]。

2.4 發(fā)酵液中NH3-N 含量

如圖4所示，發(fā)酵0～12 h，CK 組、菊糖組及WFPP-L 組培養(yǎng)液中NH3-N 含量隨著時(shí)間的延長而持續(xù)增加，而WFPP-M 及WFPP-H 兩組NH3-N 的含量逐漸降低。發(fā)酵12 h 時(shí)，WFPP-H組發(fā)酵液中NH3-N 含量達(dá)到最低值17.75 mg/mL。發(fā)酵12～48 h，各組發(fā)酵液中NH3-N 含量均上升，WFPP-H 組NH3-N 含量增幅及質(zhì)量濃度均明顯低于其它4 組，其次是WFPP-M 組。發(fā)酵0～48 h，空白組發(fā)酵液中NH3-N 含量逐漸增加，且始終高于其它4 組。添加蕎麥蜂花粉多糖能降低培養(yǎng)液中NH3-N 含量，添加量越高效果越明顯，高劑量多糖在發(fā)酵12 h 時(shí)能顯著抑制菌群產(chǎn)生NH3-N。

氨態(tài)氮是酵解過程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物。一般情況下，NH3-N 含量處于動(dòng)態(tài)平衡，受環(huán)境中蛋白降解度、微生物的合成速度及NH3-N 吸收利用等因素的影響。環(huán)境中NH3-N 含量過高，易引起氨中毒[18]。發(fā)酵0～12 h，糞便菌群主要酵解多糖生成短鏈脂肪酸，形成酸性環(huán)境，有利于腸道有益微生物的生長，提高對(duì)氨的利用。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，培養(yǎng)物中多糖逐漸被消耗，在此過程中主要進(jìn)行蛋白發(fā)酵，產(chǎn)生氨、胺及吲哚等物質(zhì)，培養(yǎng)液中NH3-N 逐漸積累[27]。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液中糖含量Fig.3 Total carbohydrate at different time points during fermentation

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的培養(yǎng)液中NH3-N 含量Fig.4 The content of NH3-N in culture medium of different fermentation time

2.5 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量的變化

乙酸、丙酸、正丁酸是體外發(fā)酵形成的主要短鏈脂肪酸，是多糖體外酵解的典型代謝產(chǎn)物。除這3 種主要SCFAs 外，在發(fā)酵過程中還產(chǎn)生少量的異丁酸、正戊酸、異戊酸，是由蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生。整個(gè)發(fā)酵過程中，WFPP 組酵解培養(yǎng)物中的SCFAs含量始終高于CK 組。除CK 組外，各組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、正丁酸及正戊酸的含量整體上是增加的，異丁酸、異戊酸含量無明顯變化，且與CK 組沒有顯著差異。發(fā)酵0～24 h，各組發(fā)酵液中乙酸含量顯著升高，WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L 及菊糖組分別從最初的4.89，4.25，4.12，3.63 mmol/L增至46.17，23.91，12.44，6.56 mmol/L；各組中丙酸含量從最初1～2 mmol/L 升至17.86，10.76，6.03，1.66，1.36 mmol/L。WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L及菊糖組的正丁酸從最初0.94，0.87，1.13，0.71 mmol/L 升至12.24，4.50，2.08，0.71 mmol/L。發(fā)酵24～48 h，各組代謝產(chǎn)物中乙酸、丙酸、丁酸含量無明顯變化，發(fā)酵36～48 h，其含量出現(xiàn)小幅下降，可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長培養(yǎng)基中菌群大量繁殖，酵解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸被菌群利用，短鏈脂肪酸逐漸被消耗，因而其含量不再增加，甚至出現(xiàn)下降。

圖5 發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液SCFAs 濃度的變化Fig.5 Changes of SCFAs concentration at different time points in fermentation cultures

SCFAs 是胃、腸道中厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生的最終代謝產(chǎn)物，易被人體吸收，被認(rèn)為是宿主腸道的重要能量來源[28]。乙酸是擬桿菌門的主要代謝產(chǎn)物，能夠進(jìn)入外周循環(huán)而被外周組織代謝；丙酸通常被肝臟代謝，可抑制膽固醇的合成，并作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量來源，起到緩解慢性腸道炎癥的作用；丁酸是一種主要由厚壁菌門產(chǎn)生的有益代謝物，能抑制去乙酰化酶活性，調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，在緩解炎癥、減少結(jié)腸癌等方面發(fā)揮著重要的作用[29]。SCFAs 通過調(diào)節(jié)宿主代謝組織中SCFAs受體和靶分子表達(dá)參與宿主生理反應(yīng)，乙酸、丙酸、丁酸均可結(jié)合并激活免疫細(xì)胞主要受體GPR41、GPR43，丁酸及β-羥基丁酸對(duì)GPR109 也有激活作用[30]。Wang 等[31]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可增加β-乳球蛋白致敏小鼠糞便短鏈脂肪酸濃度，通過誘導(dǎo)致敏小鼠脾臟和結(jié)腸中SCFAs 受體GPR41、GPR43 的表達(dá)，減輕小鼠過敏性炎癥反應(yīng)。Furusawa 等[32]提出短鏈脂肪酸可通過抑制調(diào)控基因表達(dá)蛋白HDACs 活性，促進(jìn)Foxp3 表達(dá)，從而調(diào)控Tregs 的分化與功能，影響機(jī)體免疫相關(guān)性疾病的進(jìn)展。

3 結(jié)論

通過分析不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液中pH 值、總糖、NH3-N 及短鏈脂肪酸含量變化，探究蕎麥蜂花粉多糖在人體糞便中的發(fā)酵規(guī)律，揭示不同劑量蕎麥蜂花粉多糖對(duì)人體糞便菌群的影響。結(jié)果顯示：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中pH 值逐漸降低，WFPP 的添加量越高，pH 值下降明顯。蕎麥蜂花粉多糖主要在發(fā)酵前24 h 被糞便菌群酵解利用，體外發(fā)酵24 h 后，發(fā)酵液中WFPP 消耗量均在80%以上；酵解12 h 后，添加中、高劑量的WFPP 可明顯降低培養(yǎng)液中的NH3-N 含量。除此之外，乙酸、丙酸、正丁酸是糞便腸道菌群酵解蕎麥蜂花粉多糖生成的主要短鏈脂肪酸，其主要在發(fā)酵0～24 h 產(chǎn)生，這與多糖在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律一致，且WFPP 添加量越高，酵解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸越多。綜上所述，蕎麥蜂花粉多糖在腸道中可被人糞便菌群酵解利用，產(chǎn)生的SCFAs 等代謝產(chǎn)物對(duì)腸道菌群有積極作用，有利于人體健康。