紫草油有效成分的高效液相色譜測(cè)定法及其在超臨界流體萃取制備紫草油中的應(yīng)用

沈 潔, 沈 煒, 蔡 雪, 王京霞, 鄭敏霞*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 浙江 杭州 310006; 2. 浙江工業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心, 浙江 杭州 310014)

紫草(Lithospermum erythrorhizon)是皮膚科常用的中藥之一,具有涼血、活血、解毒透疹的功效?！侗静菥V目》記載:“紫草治斑疹、痘毒,活血涼血,利大腸”,用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、濕疹、水火燙傷等。由紫草提取制備成的紫草油能夠預(yù)防及治療嬰兒尿布疹、皮膚潰爛、濕疹等多種皮膚疾患,臨床應(yīng)用非常廣泛[1]。

紫草主要的活性成分是萘醌類化合物,包括紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(β,β-dimethylacrylshikonin)等成分[2],傳統(tǒng)的提取紫草有效成分的方法主要包括有機(jī)溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法、減壓蒸餾法、油浸法等,其工藝復(fù)雜,產(chǎn)品純度不高,常用的有機(jī)溶劑提取法提取物中常含有微量有機(jī)溶劑殘留。超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近幾十年發(fā)展起來(lái)的一種新型提取技術(shù),對(duì)許多物質(zhì)有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力,且萃取物無(wú)溶劑殘留,保證產(chǎn)品100%的純天然性。梁瑞紅等[3]對(duì)新疆紫草進(jìn)行了超臨界流體萃取工藝研究并與有機(jī)溶劑萃取的結(jié)果進(jìn)行了比較,超臨界流體萃取比有機(jī)溶劑萃取能得到更多紫草萘醌類組分,且超臨界流體萃取所含的雜質(zhì)更少,超臨界流體萃取可作為紫草有效成分提取的優(yōu)選方法。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道超臨界提取紫草的研究所涉及的內(nèi)容主要有紫草有效成分的分離、純化研究[4]、CO2超臨界流體萃取紫草有效成分的穩(wěn)定性研究[5]、超臨界流體萃取紫草的有效成分的抗氧化研究[6]等。尚未見(jiàn)高效液相色譜同時(shí)測(cè)定紫草油中多種有效成分含量及用于超臨界流體萃取制備紫草油工藝優(yōu)化的研究報(bào)道,還沒(méi)有形成一套嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的工藝流程。調(diào)研國(guó)內(nèi)外關(guān)于紫草有效成分檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道,大多是對(duì)左旋紫草素[7-10]、β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧[7-9]、乙酰紫草素[9,10]、β-乙酰氧基異戊酰紫草素[10]、β,β-二甲基丙烯酰紫草素[10]、蒽醌類[11]2到3種有效成分的含量檢測(cè)或指紋圖譜研究。

本研究建立了紫草油6種有效成分含量檢測(cè)的分析方法,并以紫草油所含的有效成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化紫草超臨界流體萃取制備過(guò)程中的萃取壓力、萃取溫度和CO2流量3個(gè)制備工藝條件,確定了紫草超臨界流體萃取的最佳工藝流程,從而保證有效成分含量的穩(wěn)定性和紫草油質(zhì)量的可靠性,達(dá)到安全、有效用藥的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)(Waters, USA),配四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器(PDA)、Chem Station工作站控制系統(tǒng);KQ-100DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司); EL204電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司); MinispanPlus臺(tái)式高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore, USA)等。

紫草素(純度>99.0%)、乙酰紫草素(純度>99.0%)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(純度>99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧(純度>98.0%)、異丁酰紫草素(純度>98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,2-甲基丁?；喜菟?純度>98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海阿拉丁生化科技有限公司;甲酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈(色譜純,德國(guó)默克公司);甲酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);Milli-Q超純水。

新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房鄭敏霞主任中藥師鑒定。

1.2 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動(dòng)相:含0.1%甲酸的乙腈-含5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液(75∶25, v/v),等度洗脫,流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為15 μL;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取6種紫草素標(biāo)準(zhǔn)品適量,用乙腈-水溶液(75∶25, v/v)溶解,并定容于10 mL容量瓶中,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,于4 ℃避光保存。儲(chǔ)備液中紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁酰基紫草素的質(zhì)量濃度分別為100、500、400、600、500、1 000 μg/L。

分別精密吸取儲(chǔ)備液適量,并稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度如下:紫草素10、20、30、40、50 μg/L,乙酰紫草素50、100、150、200、250 μg/L,β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧40、80、120、160、200 μg/L,異丁酰紫草素60、120、180、240、300 μg/L,β,β-二甲基丙烯酰紫草素0、100、150、200、250 μg/L, 2-甲基丁?；喜菟?00、200、300、400、500 μg/L。

1.4 供試品溶液制備

取紫草超臨界流體萃取所得的樣品1 mg,精密稱定,溶于1 mL乙腈-水(75∶25, v/v)溶液中,超聲1 min,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,濾液作為供試品溶液,供分析用。

1.5 超臨界流體萃取制備紫草油

選取新疆紫草,碾碎,粗粉碎物料過(guò)篩。紫草裝料量250 g, CO2超臨界流體萃取時(shí)間2 h,無(wú)夾帶劑,一級(jí)分離,萃取壓力23 MPa,萃取溫度40 ℃, CO2流量27 L/h。

2 結(jié)果和討論

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1有效成分檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

《中國(guó)藥典》記載紫草有效成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為516 nm和275 nm[7],部分文獻(xiàn)報(bào)道紫草有效成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為516 nm[11],我們對(duì)紫草油的6種有效成分進(jìn)行了光譜掃描,結(jié)果如圖1所示,可以看出在275 nm和516 nm處,紫草油的6種有效成分均有較高的吸收度,但在275 nm處,6種有效成分的吸收度更高,因此選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 1 紫草油中6種有效成分的PAD光譜圖Fig. 1 Spectra of six active components in lithospermum oil with photodiode array detector (PAD)

2.1.2HPLC流動(dòng)相的優(yōu)化

色譜條件優(yōu)化過(guò)程中,對(duì)流動(dòng)相溶劑(甲醇、乙腈)、流動(dòng)相酸度(0.25%、0.05%、0.1%、0.2%)和流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙腈對(duì)紫草油有效成分的洗脫能力強(qiáng)于甲醇,使得分離時(shí)間明顯縮短,而且分離效果也比較好;流動(dòng)相的酸度對(duì)紫草油有效成分的分離度有一定的影響,隨著酸度的增大,色譜峰的峰形得到改善,但是考慮到過(guò)高的酸度可能對(duì)色譜柱的使用壽命產(chǎn)生影響,所以最終選擇酸度為0.1%;流動(dòng)相流速選擇1.0 mL/min最為適合。色譜條件優(yōu)化后的紫草油標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖 2 優(yōu)化條件下紫草油標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC譜圖Fig. 2 HPLC profiles of lithospermum oil standards and samples under optimized chromatographic conditions 1. shikonin; 2. acetylshikonin; 3. β-acetoxyisovaleryl akanin; 4. isobutyryl shikonin; 5. β,β-dimethylacryl shikonin; 6. 2-methylbutyryl.

2.2 HPLC方法學(xué)考察

采用優(yōu)化后的液相色譜條件,進(jìn)樣分析一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程,如表1所示,線性關(guān)系良好。信噪比(S/N)=3的進(jìn)樣質(zhì)量濃度即檢出限(LOD),S/N=10的進(jìn)樣質(zhì)量濃度即定量限(LOQ),結(jié)果如表1所示,方法靈敏度高。

表 1 6種有效成分的線性關(guān)系、檢出限和定量限(n=3)

配制1份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁?；喜菟刭|(zhì)量濃度分別為30、150、120、180、150、300 μg/L,同一天內(nèi)取樣6次進(jìn)樣分析,計(jì)算日內(nèi)精密度;配制1份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合標(biāo)準(zhǔn)品中各成分紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁酰基紫草素質(zhì)量濃度分別為40、200、160、240、200、400 μg/L,連續(xù)6日每日進(jìn)樣分析,計(jì)算日間精密度,結(jié)果如表2所示,精密度良好。

表 2 日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液進(jìn)樣分析評(píng)估重復(fù)性,結(jié)果見(jiàn)表3。按供試品溶液制備方法制備1份供試品溶液,分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析評(píng)估穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

按加樣回收率測(cè)定方法,分別在已知含量的樣品中,加入一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照供試品溶液制備方法制備供試品6份,進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 HPLC分析方法的加樣回收率結(jié)果(n=6)

以上結(jié)果證明該分析方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度良好。此分析方法可用于紫草油中6種有效成分的定量分析,有效成分的含量指標(biāo)可應(yīng)用于評(píng)價(jià)超臨界流體萃取制備紫草油工藝的優(yōu)化過(guò)程。

2.3 超臨界流體萃取制備紫草油的工藝條件篩選

選取新疆紫草,碾碎,粗粉碎物料過(guò)篩。每組實(shí)驗(yàn)裝料量250 g, CO2超臨界流體萃取時(shí)間2 h,無(wú)夾帶劑,一級(jí)分離,采用三因素三水平正交試驗(yàn)法,正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表5,實(shí)驗(yàn)組別見(jiàn)表6,考察萃取壓力、萃取溫度和CO2流量對(duì)紫草有效成分含量的影響。9組試驗(yàn)所得的紫草油樣品通過(guò)上述已建立的HPLC分析方法檢測(cè)有效成分含量,有效成分含量結(jié)果見(jiàn)表7,HPLC譜圖見(jiàn)圖3。

表 5 正交試驗(yàn)因素水平表

表 6 超臨界流體萃取制備紫草油工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)表

表 7 9組超臨界流體萃取工藝制備所得紫草油的有效

圖 3 9組超臨界流體萃取工藝制備所得紫草油的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of lithospermum oil prepared by nine supercritical extraction processes Samples S1-S9: obtained from Tests 1-9 in Table 6. 1. shikonin; 2. acetylshikonin; 3. β-acetoxyisovaleryl akanin; 4. isobutyryl shikonin; 5. β,β-dimethylacryl shikonin; 6. 2-methylbutyryl.

影響超臨界流體萃取有效成分的主要因素有萃取壓力、萃取溫度和CO2流量,本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平正交試驗(yàn)法來(lái)優(yōu)化紫草超臨界流體萃取的工藝條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)1至試驗(yàn)9所得的紫草油有效成分的總量分別是S1=562.59 μg/L, S2=604.64 μg/L, S3=818.74 μg/L, S4=738.42 μg/L, S5=909.84 μg/L, S6=977.84 μg/L, S7=880.54 μg/L, S8=713.61 μg/L, S9=809.54 μg/L。試驗(yàn)6的工藝條件所得的紫草油有效成分含量最高,且試驗(yàn)6所需的CO2流量最少,符合工業(yè)化大生產(chǎn)的需求。所以超臨界流體萃取制備紫草油的最優(yōu)工藝條件是:萃取壓力23 MPa,萃取溫度40 ℃, CO2流量27 L/h。

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-PAD法同時(shí)測(cè)定紫草油中6種有效成分含量的分析方法,并將此方法應(yīng)用于超臨界流體萃取制備紫草油的工藝優(yōu)化過(guò)程,優(yōu)化后的工藝條件能夠滿足紫草油制備需求,有效成分含量穩(wěn)定。本方法簡(jiǎn)便可行、準(zhǔn)確可靠,可用于超臨界流體萃取制備紫草油的工藝過(guò)程和質(zhì)量控制。