基于手性固定相的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測小麥及其加工制品中的腈菌唑?qū)τ丑w

齊艷麗, 高 婧, 王偉榮, 金 靜, 呂 瑩, 秦 曙

(山西功能農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測中心, 山西農(nóng)業(yè)大學, 山西 太原 030031)

手性是指實物與鏡像對稱卻不能重疊的性質(zhì),手性分子存在一對基團組成相同但空間結(jié)構(gòu)互為鏡像關(guān)系的對映異構(gòu)體,簡稱對映體[1]。具有這種性質(zhì)的農(nóng)藥稱為手性農(nóng)藥。手性農(nóng)藥在農(nóng)藥市場中占據(jù)重要地位,目前使用的農(nóng)藥中≥30%為手性農(nóng)藥[2]。手性農(nóng)藥對映體在非手性環(huán)境下的理化性質(zhì)沒有明顯差異,但在手性條件下,尤其是生物體內(nèi)酶、激素等手性環(huán)境中,其代謝降解、生物活性及毒性毒理等方面存在顯著差別[3]。近年來,隨著人們對手性化合物的深入了解,建立快速簡單的手性農(nóng)藥對映體分離及殘留分析方法越來越受到重視。常見的手性化合物拆分方法以色譜拆分法為主。色譜拆分法包括氣相色譜法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法、毛細管電泳法等,其中高效液相色譜法是應用最廣泛的方法。目前高效液相色譜手性拆分方法中,手性固定相法由于具有簡單、快速等優(yōu)點被廣泛使用[4,5]。

腈菌唑(myclobutanil)屬于三唑類手性殺菌劑,分子中有1個手性中心,存在2個對映異構(gòu)體S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑[6],其結(jié)構(gòu)式見圖1。腈菌唑目前主要以外消旋體形式銷售并使用,其登記作物主要有黃瓜、香蕉、小麥、梨等[7]。由于用量較小、藥效較高、低毒、對小麥白粉病有較好的防治效果等優(yōu)點,腈菌唑在小麥上應用廣泛。研究表明,腈菌唑?qū)τ丑w在生物活性、毒性、降解等方面具有選擇性:S-(+)-腈菌唑的殺菌活性明顯優(yōu)于R-(-)-腈菌唑[8];S-(+)-腈菌唑?qū)旁宓亩拘员萊-(-)-腈菌唑高[9];S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在人肝微粒體中代謝具有對映選擇性的差異,人類CYP450酶不代謝R-(-)-腈菌唑[10];R-(-)-腈菌唑在蜥蜴中的富集高于其異構(gòu)體[11];在葡萄、大鼠肝細胞及肝微粒體中S-(+)-腈菌唑優(yōu)先降解,R-(-)-腈菌唑相對富集[6,12]。為進一步深入研究手性農(nóng)藥腈菌唑?qū)τ丑w在殘留降解、環(huán)境行為等方面的差異,建立其在不同基質(zhì)中的分離及殘留分析方法尤為重要。

圖 1 腈菌唑?qū)τ丑w的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of myclobutanil enantiomers

目前,手性農(nóng)藥腈菌唑?qū)τ丑w在不同基質(zhì)中的手性殘留分析已有報道。張文華等[13]利用超高效合相色譜(ACQUITYUPC2Trefoil AMY1色譜柱)建立了腈菌唑?qū)τ丑w在黃瓜中的殘留分析方法。張新忠等[14]采用超高效合相色譜(ChromegaChrial CCA色譜柱)-四極桿飛行時間質(zhì)譜,建立了腈菌唑?qū)τ丑w在蘋果、葡萄和茶葉中的分離及殘留分析方法。Yang等[15]利用超高效合相色譜(ACQUITYUPC2Trefoil AMY1色譜柱)-串聯(lián)質(zhì)譜建立了腈菌唑?qū)τ丑w在煙草中的檢測方法。孫彥等[16]利用超高效液相色譜(Lux Cellulose-4手性色譜柱)-串聯(lián)質(zhì)譜建立了番茄、苦瓜、黃瓜和胡蘿卜中腈菌唑?qū)τ丑w的分離方法。Li等[17]利用一種新型手性固定相(3,5-二氯苯氨基化纖維素鍵合硅膠固定相),用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了腈菌唑?qū)τ丑w在10種蔬菜及水果中的手性分析方法。

本研究以小麥及其加工制品為研究對象,基于手性固定相,利用的UPLC-MS/MS建立了腈菌唑?qū)τ丑w的分離及殘留分析方法,可用于不同初級農(nóng)產(chǎn)品及加工食品中的手性農(nóng)藥對映體的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

腈菌唑標準品(99.9%,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH);乙腈(HPLC級,美國Tedia公司);甲醇(HPLC級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、甲酸(HPLC級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司);乙酸銨(HPLC級,天津市光復精細化工研究所);氯化鈉(分析純,北京化工廠);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18(分析純,島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司)吸附劑;純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

供試小麥樣品來自山西省農(nóng)業(yè)科學院東陽試驗基地,樣品經(jīng)脫粒后冷凍保存。

1.2 樣品的制備

小麥籽粒樣品:取部分小麥籽粒樣品用粉碎機打碎,得到均質(zhì)的小麥籽粒樣品。

麩皮和面粉樣品:部分小麥籽粒樣品用磨粉機磨粉、過篩,得到麩皮和面粉樣品。

饅頭樣品:稱取100 g面粉,加入含有1 g干酵母的溫水(約38 ℃)約48 mL,用筷子混合成面團后,手工揉3 min,于38 ℃恒溫箱中醒發(fā)1 h,取出再揉3 min成型,在室溫放置15 min,放入已煮沸并墊有紗布的蒸鍋屜上蒸20 min (冒氣時開始計時),取出并蓋上干紗布冷卻40～60 min。將饅頭樣品切成小碎塊,備用。

面團樣品:取300 g面粉,加入溫水(約30 ℃),用筷子混合成面團后,手工揉10 min,在室溫下靜置20 min。將面團樣品切成小碎塊,備用。

煮面水及面條樣品:取部分上述面團樣品用小型面條機壓片,將面片逐漸壓薄至1.0 mm,在將面片壓成2.0 mm寬的細長面條束。量取500 mL自來水于鍋中,在電磁爐上煮沸,稱取50 g面條樣品,放入鍋內(nèi),煮至面條芯的白色生粉剛剛消失,立即將面條撈出,以流動的自來水沖淋約10 s。得到煮面水及面條樣品。再將面條樣品切成小碎塊,備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

柔性直流輸電系統(tǒng)孤島運行方式下的故障電流抑制方法//王慶,盧宇,胡兆慶,王柯,李海英,劉海彬//(7):56

小麥及其加工制品中腈菌唑?qū)τ丑w的提取方法采取改進的QuEChERS方法進行。

稱取5 g樣品(小麥籽粒、麩皮、面粉、饅頭及煮面水),加入5 mL水(煮面水樣品不加),加入10 mL乙腈,2 500 r/min下渦旋5 min, 8 000 r/min下離心5 min。

稱取5 g樣品(面團及面條),加入5 mL水,加入10 mL乙腈,12 000 r/min下均質(zhì)提取1 min,加入5 g氯化鈉,2 500 r/min下渦旋2 min, 8 000 r/min下離心5 min。

1.3.2樣品凈化

吸取上述提取液1 mL于盛有25 mg C18及25 mg PSA吸附劑的小離心管中,2 500 r/min下渦旋2 min, 2 500 r/min下離心2 min。吸取0.5 mL上清液,加入0.5 mL純凈水,混勻,過有機微孔濾膜(0.22 μm),待進UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜條件:Lux Cellulose-1手性色譜柱(150 mm×2.0 mm, 3 μm);流速為0.25 mL/min;進樣量為5 μL;柱溫30 ℃;流動相A為4 mmol/L的乙酸銨水溶液,B為4 mmol/L的乙酸銨甲醇溶液,均含體積分數(shù)為0.1%的甲酸;其比例為A: 25%, B: 75%。

質(zhì)譜條件:電噴霧正離子掃描(ESI+);多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度400 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h;碰撞氣為氬氣,純度>99.999%。腈菌唑定性離子對為m/z288.9/124.9和m/z288.9/69.6;錐孔電壓均為36 V;碰撞能量分別為24 eV和38 eV;其中m/z288.9/69.6為定量離子對。

1.5 標準溶液的配制

準確稱取10 mg(精確到0.1 mg)腈菌唑標準品,用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中,配成1 g/L的標準儲備溶液,于≤-18 ℃條件下避光保存,備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的選擇

利用色譜法可以有效地實現(xiàn)手性農(nóng)藥的分離與檢測,而手性固定相是手性色譜分離的關(guān)鍵所在[18]。多糖類物質(zhì)是液相色譜法中最常用的一類手性選擇劑。Lux Cellulose-1色譜柱以手性選擇劑纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)修飾的硅膠為填料,是改良的多糖型手性固定相,在手性農(nóng)藥對映體的分離分析中具有較好的拆分效果[19-22]。故本研究選擇Lux Cellulose-1作為手性分離色譜柱。

2.2 腈菌唑?qū)τ丑w的拆分

本研究利用手性色譜柱Lux Cellulose-1在甲醇/水體系下對腈菌唑?qū)τ丑w進行了拆分。已有文獻[20]表明腈菌唑?qū)τ丑w在Lux Cellulose-1手性色譜柱上的出峰順序不隨流動相及柱溫的改變而改變。由此可知,在本實驗儀器條件下,S-(+)-腈菌唑?qū)τ丑w先出峰,R-(-)-腈菌唑?qū)τ丑w后出峰,保留時間分別為4.34 min和5.13 min。如圖2所示,腈菌唑的兩個對映體得到良好的拆分。

圖 2 腈菌唑?qū)τ丑w的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of myclobutanil enantiomers

2.3 基質(zhì)效應

在UPLC-MS/MS分析中,尤其是使用ESI源時,由于共流出化合物在色譜系統(tǒng)中的離子競爭,基質(zhì)效應(離子抑制或離子增強)普遍存在[23]。一般通過比較待測物在樣品及純?nèi)軇┲械捻憫祦泶_定基質(zhì)效應的存在[24]?；|(zhì)效應由Matuszewki等[25]修正的公式來計算:基質(zhì)效應=(R樣品/R溶劑-1)×100%,其中R樣品為樣品空白基質(zhì)提取液中腈菌唑?qū)τ丑w的峰響應,R溶劑為乙腈溶液中腈菌唑?qū)τ丑w的峰響應?；|(zhì)效應為負值時,產(chǎn)生離子抑制效應;基質(zhì)效應為正值時,產(chǎn)生離子增強效應?；|(zhì)效應在-20%～0或0～20%時為弱基質(zhì)效應,在-50%～-20%或20%～50%時為中等基質(zhì)效應,小于-50%或大于50%時為強基質(zhì)效應[26]。

腈菌唑?qū)τ丑w在小麥籽粒及其相關(guān)加工制品中的基質(zhì)效應見表1。腈菌唑?qū)τ丑w在小麥及其加工制品中的基質(zhì)效應均在-20%～0或0～20%之間,表明存在弱基質(zhì)效應。其中,S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在小麥籽粒(wheat grain)、麩皮(bran)、面團(pasta)、饅頭(steamed bun)和面條(noodle)中存在弱基質(zhì)減弱效應,S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在面粉(flour)和煮面水(cooking water)中存在弱基質(zhì)增強效應。

表 1 腈菌唑?qū)τ丑w的基質(zhì)效應

基質(zhì)效應產(chǎn)生的機理尚不明確且影響因素眾多。為提高定量結(jié)果的準確度及精密度,在農(nóng)藥殘留分析中通常采用基質(zhì)匹配標準溶液校準方法來消除與補償基質(zhì)效應。因此,本文使用基質(zhì)匹配標準溶液校準方法來定量分析物。

2.4 方法驗證

分別用小麥籽粒、麩皮、面粉、面團、饅頭、面條、煮面水空白樣品基質(zhì)提取液配制成腈菌唑?qū)τ丑w質(zhì)量濃度為0.5、1.25、5、12.5、25 μg/L的標準工作溶液,以進樣質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標、化合物峰面積響應值為縱坐標繪制標準曲線。

在0.5～25 μg/L的范圍內(nèi),腈菌唑?qū)τ丑w的峰面積與其質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)在0.999 5～1之間(見表2)。

表 2 腈菌唑?qū)τ丑w的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)

以3倍信噪比及10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在小麥及其加工制品樣品中的檢出限均為0.2 μg/kg,定量限均為0.5 μg/kg。

在小麥籽粒、麩皮、面粉、面團、饅頭、面條、煮面水空白樣本中添加腈菌唑標準溶液(添加水平為5、50、100 μg/kg),進行回收率測定,添加回收率結(jié)果見表3。S-(+)-腈菌唑在小麥籽粒及其加工制品中平均回收率在82%～110%之間,RSD在0.9%～6.8%之間;R-(-)-腈菌唑在小麥籽粒及其加工制品中平均回收率在80%～109%之間,RSD在0.9%～6.8%之間。結(jié)果表明該方法具有較好的準確性及重現(xiàn)性。

表 3 腈菌唑?qū)τ丑w在小麥及其加工制品中的平均添加回收率(n=5)

2.5 實際樣品的檢測

將該方法用于實際樣品的檢測。結(jié)果表明,在5份面粉、2份面條及2份饅頭樣品中均未檢出(≤LOD)腈菌唑?qū)τ丑w。

3 結(jié)論

本文建立了基于手性固定相的UPLC-MS/MS測定小麥籽粒及其加工制品中腈菌唑?qū)τ丑w的殘留分析方法。該方法高效、簡單,同時具有較高的靈敏度及精密度,為手性農(nóng)藥腈菌唑?qū)τ丑w在初級農(nóng)產(chǎn)品及其加工制品中的殘留分析提供了有效的方法。