復(fù)合因素糖尿病下肢潰瘍大鼠模型建立的初探

王鑫，許志明，李曉陽(yáng)，石育弘，曾昭洋*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

0 引言

糖尿病足潰瘍(DFU)是糖尿病患者可能面臨的最漫長(zhǎng)且代價(jià)高昂的挑戰(zhàn)，同時(shí)DFU 往往會(huì)發(fā)生在5-7%的糖尿病患者人群中[1]。并且這些潰瘍中有又有一半以上是因?yàn)楸桓腥綶2]。在大多數(shù)情況下，嚴(yán)重的感染才是導(dǎo)致DFU 患者全肢體截肢的重要原因[3]。同時(shí)有研究指出金黃色葡萄球菌是DFU 中感染的主要微生物[4]。糖尿病足(DF)的病理過(guò)程非常復(fù)雜，涉及皮膚、肌肉、肌腱、骨、神經(jīng)和血管的損傷。而糖尿病足感染(DFI)是指微生物的入侵及其在宿主組織中的繁殖，在臨床中通常引發(fā)于體表屏蔽層的不慎開(kāi)裂破損。本研究擬制備一種符合糖尿病下肢潰瘍發(fā)病過(guò)程的可操作性強(qiáng)的復(fù)合因素模型，在高脂高糖飼料投喂下聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠基礎(chǔ)上，采用彈性膠布包裹，足底皮膚切除，創(chuàng)面肌腱下注射金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株來(lái)建立復(fù)合因素糖尿病潰瘍模型，以期為更加符合臨床發(fā)病危險(xiǎn)因素特點(diǎn)的糖尿病下肢潰瘍模型提供新思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2020—0009)，體重(180±20)g。

1.2 藥物及試劑設(shè)備

STZ 鏈脲佐菌素(Sigma 公司)；檸檬酸(北京索萊寶科技有限公司)；檸檬酸鈉(北京索萊寶科技有限公司)；質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌-ATCC29213，菌懸液濃度1×108/mL(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)；羅氏活力型血糖儀(蘭州科寶生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分組給藥

糖尿病模型的制備首先對(duì)SD 大鼠進(jìn)行高脂高糖飼料投喂1 月，禁食1 日后腹腔注射STZ 35mg/kg，假手術(shù)組注射同等計(jì)量的檸檬酸鈉緩沖液。3 日后測(cè)空腹血糖大于11.1mmol/L 或隨機(jī)血糖大于16.7mmol/L 視為造模成功，并應(yīng)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周復(fù)測(cè)血糖，及時(shí)剔除回落不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。糖尿病大鼠模型制備后1 周復(fù)測(cè)血糖符合標(biāo)準(zhǔn)后，開(kāi)始進(jìn)行糖尿病潰瘍?cè)炷?。將大鼠右后腿用外科彈性膠布包裹4小時(shí)后，松開(kāi)膠布。腹腔注射麻醉大鼠，所用藥物為3%戊巴比妥鈉(劑量為0.1mL/100g)。麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后，右后足剃凈絨毛，碘伏消毒三遍。用手術(shù)刀及組織剪在每只大鼠右足底爪墊后跟上，沿其自然分界剪切出了一個(gè)上底為8mm，下底為3mm，高為15mm 的梯形全層傷口。具體過(guò)程為去除全層皮膚，粗紗布拭去淺層組織并逐漸至深筋膜，后用組織剪分離深達(dá)深筋膜下，并顯露出大鼠足底肌腱，使用止血鉗內(nèi)側(cè)面機(jī)械損傷肌腱。術(shù)中使用棉球止血，待出血停止后，進(jìn)行感染菌的接種。將金黃色葡萄球菌懸液(濃度1×108/mL)用磷酸鹽緩沖液(PBS)10 倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)足底創(chuàng)面朝足尖方向注射該濃度菌液0.1mL。

具體分組為，從30 只SD 大鼠中選擇10 只作為假手術(shù)組，其余大鼠均進(jìn)行糖尿病造模，建造成功后。隨機(jī)將糖尿病大鼠分為復(fù)合因素組(n=10)和單純切除組(n=10)。將三組大鼠進(jìn)行下肢潰瘍?cè)炷：?，術(shù)后常規(guī)包扎1 日，于第2 日開(kāi)始松開(kāi)紗布，使其自然愈合。觀察三組下肢潰瘍創(chuàng)面愈合情況。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況觀察

觀察大鼠造模前后大鼠外觀、尿量及活動(dòng)情況。

2.2.2 大鼠體重檢測(cè)

分別于腹腔注射STZ 前，注射后2、4、6 周分別測(cè)量各組大鼠空腹體重。

2.2.3 大鼠血糖監(jiān)測(cè)

分別于腹腔注射STZ 前，注射后3、7、14 天分別監(jiān)測(cè)大鼠空腹血糖(Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG)、餐后2 小時(shí)血糖(Postprandial Blood Glucose，PBG)；具體測(cè)量方法：將大鼠置于大鼠固定裝置后，尾端顯露于其外，將試紙插進(jìn)血糖儀待血糖儀指示后，用75%的酒精消毒大鼠尾尖，采血針垂直刺入，用另只手的大拇指和食指由大鼠尾巴近心端向遠(yuǎn)心端驅(qū)血，無(wú)菌棉球拭去第一滴血，再驅(qū)血讓血液沾染到試紙(試紙上橫向黑色條為采血處)即可。

2.2.4 創(chuàng)面愈合率

將三組大鼠進(jìn)行下肢潰瘍?cè)炷：?，術(shù)后常規(guī)包扎1 日，于第2 日開(kāi)始松開(kāi)紗布，待其自然愈合。觀察三組下肢潰瘍創(chuàng)面愈合情況。期間觀察每只大鼠的活動(dòng)、進(jìn)食、飲水及其他異常情況。各組大鼠均于制創(chuàng)后的第3，7，14 對(duì)大鼠進(jìn)行潰瘍創(chuàng)面拍照，用Image J 軟件測(cè)定潰瘍創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。其中創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.2.5 創(chuàng)面愈合時(shí)間

以創(chuàng)面愈合面積≥95%糖尿病下肢潰瘍面積為完全愈合，分別記錄每只小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間。

2.2.6 于潰瘍形成后第14 天三組各隨機(jī)取1 只大鼠,切取大鼠足底潰瘍面及周?chē)珜悠つw,10%多聚甲醛固定,石蠟包埋,HE 染色,光鏡下觀察愈合情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果用表示，所有數(shù)據(jù)做方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況

大鼠腹腔給予STZ 后，第3 日即出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿及糞便增多現(xiàn)象，其中尤以多飲、多尿最顯著。彌漫爛蘋(píng)果樣的特殊氣味等典型的糖尿病癥狀，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上述癥狀逐漸加重。至第2 周逐漸開(kāi)始，單純切除組與復(fù)合因素組均出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)遲緩，皮毛灰黃無(wú)光澤，消瘦，飲水量及小便量已達(dá)到正常大鼠的5～6 倍，進(jìn)食量為正常大鼠的2～3倍。假手術(shù)組組大鼠則精神良好，行動(dòng)敏捷，二便正常，體重逐漸增長(zhǎng)。

足底制創(chuàng)后，假手術(shù)組大鼠潰瘍面肉芽組織爬生良好，滲出物較少；復(fù)合因素組糖尿病足底制創(chuàng)后患足紅腫、感染、黃色膿性分泌物形成。而單純切除組下肢潰瘍面僅變現(xiàn)為紅腫，滲出物稍多。

3.2 大鼠體重變化

腹腔給藥STZ 前，三組大鼠之間體重?zé)o明顯變化。給藥后第2 天，單純切除組、復(fù)合因素組大鼠尿量明顯增加，假手術(shù)組無(wú)明顯變化。給藥后前3 天，三組大鼠體重?zé)o明顯變化；給藥后2w、4w、6w 測(cè)量大鼠體重，單純切除組、復(fù)合因素組大鼠體重逐漸減輕，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；給藥后，單純切除組、復(fù)合因素組大鼠體重均減輕，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重情況()

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重情況()

3.3 大鼠血糖的變化

腹腔給藥STZ 前，三組大鼠空腹血糖無(wú)明顯變化；給藥后3d、7d、14d 檢測(cè)FBG、PBG，結(jié)果顯示單純切除組、復(fù)合因素組空腹血糖較假手術(shù)組明顯升高，給藥后，單純切除組與復(fù)合因素組FBG、PBG 升高水平的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；假手術(shù)組FBG、PBG 較前無(wú)明顯變化。給藥后2w，單純切除組與復(fù)合因素組整體血糖水平逐漸呈上升趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 給藥后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FBG、PBG 水平()

表2 給藥后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FBG、PBG 水平()

3.4 創(chuàng)面愈合情況及愈合率見(jiàn)表3 及

表3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較()

表3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較()

各組大鼠創(chuàng)面隨著時(shí)間推移不斷愈合，其中假手術(shù)組愈合效果最好，其次為單純切除組，而復(fù)合因素組愈合率最差。復(fù)合因素組與單純切除組相比，在第3 天、7 天和14 天的創(chuàng)面愈合率顯著降低(P＜0.05)；與假手術(shù)組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3.5 創(chuàng)面愈合時(shí)間

與其他組相比，復(fù)合因素組糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而單純切除組創(chuàng)面愈合時(shí)間長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率()

表4 各組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率()

3.6 糖尿病足潰瘍大鼠模型制作結(jié)果

病理學(xué)觀察：潰瘍形成后第14 天，病理結(jié)果示復(fù)合因素組局部覆蓋血痂，肉芽組織較多，表皮覆蓋不完全，創(chuàng)面炎癥反應(yīng)重，愈合差；單純切除組肉芽組織不明顯，表皮覆蓋完整，皮下纖維組織排列規(guī)則，見(jiàn)有散在炎性細(xì)胞，愈合尚好。而假手術(shù)組則較單純切除組新生血管變得豐富，且管腔較大，大量的紅細(xì)胞位于管腔中。復(fù)合因素組成功建立糖尿病下肢潰瘍模型。

4 討論

糖尿病下肢潰瘍作為糖尿病的并發(fā)癥之一，具有遷延難愈、治療過(guò)程漫長(zhǎng)且反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，往往使患者及其家庭的現(xiàn)實(shí)負(fù)擔(dān)加重并身心俱疲[5]。糖尿病下肢潰瘍的發(fā)生是由血管病變、神經(jīng)病變、局部感染及足底生物力學(xué)改變等多種危險(xiǎn)因素共同作用的病理結(jié)果。在研究中，重要的是動(dòng)物模型要模擬病人傷口愈合延遲的潛在病理生理機(jī)制。但目前，對(duì)于哪種動(dòng)物模型最能代表人類(lèi)糖尿病下肢潰瘍尚無(wú)共識(shí)[6]。在過(guò)去的糖尿病下肢潰瘍研究中，切除傷口模型被認(rèn)為更適合研究潰瘍傷口愈合，因?yàn)樗鼤?huì)產(chǎn)生更多的疤痕組織便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析[7]。通常在大鼠或小鼠背部造成傷口[8-11]。但這些傷口模型都沒(méi)有使用2 型糖尿病動(dòng)物而是1 型糖尿病。由于全世界90%的糖尿病患者患有2 型糖尿病[12]，并在此基礎(chǔ)上不慎形成糖尿病下肢潰瘍。上述模型的造模方式的優(yōu)勢(shì)在于，進(jìn)行創(chuàng)面面積的量化分析便于臨床實(shí)際中的療效評(píng)價(jià)，尤其是用于外用輔料及藥物的研究，可獲得能夠分辨新生上皮與肉芽界限的圖像。Jeremy Rich 等[13]建立的金黃色葡萄球菌感染NOD 小鼠后肢模型，該研究采用金黃色葡萄球菌感染的方法對(duì)糖尿病下肢潰瘍模型的建立具有重要的借鑒價(jià)值。由于骨骼和皮膚之間的軟組織很薄，機(jī)械壓力和剪切力的緩解是糖尿病下肢潰瘍管理中的一個(gè)關(guān)鍵因素[14]。在模擬糖尿病下肢潰瘍生物力學(xué)因素時(shí)，局部加壓對(duì)末梢微循環(huán)及神經(jīng)改變很有意義。同時(shí)，將潰瘍面建立在大鼠足底也更加符合臨床實(shí)際發(fā)病過(guò)程，且這種潰瘍面常規(guī)包扎后由于大鼠活動(dòng)的進(jìn)行依然產(chǎn)生慢性機(jī)械損傷，這將與糖尿病下肢潰瘍遷延難愈的病理表現(xiàn)一致。因此建立一個(gè)與臨床發(fā)病危險(xiǎn)因素相符合的動(dòng)物模型對(duì)于糖尿病下肢潰瘍的研究是有現(xiàn)實(shí)意義的，而且應(yīng)該是2 型糖尿病基礎(chǔ)上的足底復(fù)合因素的模型。

課題組通過(guò)建立這種符合糖尿病下肢潰瘍發(fā)病過(guò)程的可操作性強(qiáng)的復(fù)合因素模型，結(jié)果表明投喂高脂高糖飼料聯(lián)合STZ 給藥注射后，糖尿病模型穩(wěn)定。同假手術(shù)組比較，單純切除組與復(fù)合因素組大鼠體重逐漸減輕；單純切除組、復(fù)合因素組FBG、PBG 水平相比較假手術(shù)組明顯升高。模擬糖尿病下肢潰瘍發(fā)病的多種危險(xiǎn)因素，采用包括了局部加壓、全層足底皮膚切除、機(jī)械毀傷并接種感染菌液的復(fù)合方式后，假手術(shù)組大鼠潰瘍面肉芽組織爬生良好，滲出物較少；復(fù)合因素組糖尿病足底制創(chuàng)后患足紅腫、感染、黃色膿性分泌物形成。而單純切除組下肢潰瘍面僅變現(xiàn)為紅腫，滲出物稍多。結(jié)合大鼠一般情況該模型比較符合臨床2 糖尿病患者因足部外屏障破裂遷延難愈發(fā)展為糖尿病下肢潰瘍的病理過(guò)程。

綜上所述，建立這種與臨床發(fā)病危險(xiǎn)因素相符合的2 型糖尿病基礎(chǔ)上的足底復(fù)合因素模型是便于糖尿病下肢潰瘍研究的。