瓜類褪綠黃化病毒及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

韓 盛，麥麥提艾力·阿卜杜納斯?fàn)?，?渡，溫且木·阿布列孜，玉山江·麥麥提

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2.阿勒泰市菜籃子工程辦公室，新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbitchloroticyellowsvirus, CCYV)屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)[1]。CCYV主要侵染甜瓜、黃瓜、西瓜等作物[1, 2]，引起葉片褪綠和黃化，但葉脈仍然保持綠色，嚴(yán)重時(shí)整株葉片變黃，已經(jīng)成為制約瓜類作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病毒?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】于2004年，CCYV最早發(fā)現(xiàn)于日本的甜瓜上，至今已在中國[2, 3]、蘇丹[4]、黎巴嫩[5]、伊朗[6]、希臘[7]、埃及[8]、沙特阿拉伯[9]等國家發(fā)現(xiàn)。2011年，中國上海市、浙江省、山東省陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CCYV，之后在中國河南、海南[10]、新疆[11]、湖南[12]、廣西[13]等省(自治區(qū))也發(fā)現(xiàn)該病毒。該病毒主要由B型和Q型煙粉虱(Bemisia tabaci Biotype B和Q)以半持久性方式傳播，Q型傳毒效率高于B型[14-16]。CCYV在瓜類作物上的發(fā)生與傳播媒介煙粉虱的群體種類和數(shù)量存在密切關(guān)系[14]。新疆大部分地區(qū)都發(fā)現(xiàn)煙粉虱，存在發(fā)生CCYV的風(fēng)險(xiǎn)[17]。2016年，中國新疆吐魯番大田復(fù)播甜瓜報(bào)道CCYV的發(fā)生，并且不斷擴(kuò)散蔓延[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近幾年在我國新疆南疆甜瓜主產(chǎn)區(qū)甜瓜葉片黃化癥狀比較常見，但對新疆南疆甜瓜CCYV的發(fā)生與分布，未見報(bào)道。研究南疆甜瓜產(chǎn)區(qū)CCYV的分布、分子變異以及進(jìn)化。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究從中國新疆洛浦縣、疏勒縣、疏附縣、巴楚縣、阿克蘇市、莎車縣、伽師縣甜瓜田間采集黃化癥狀的51份葉片樣品，通過RT-PCR檢測CCYV的特異性片段，并克隆序列后進(jìn)行核酸和系統(tǒng)分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

在2019年隨機(jī)收集中國新疆洛浦縣、疏勒縣、疏附縣、巴楚縣、阿克蘇市、莎車縣、伽師縣的具有黃化癥狀甜瓜葉片樣品，保存至-80℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 CCYV的RT-PCR

將總RNA根據(jù)制造商的說明書(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行CCYV的RT-PCR檢測，正向引物為5′-GAGGATGGAGCCGAGTTAT-3′，反向引物為5′-GTGCCAACTGAGACACGTTA-3′。PCR反應(yīng)體系：2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)、cDNA 1 μL、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR儀程序包括：95℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，最終72℃總延伸10 min，將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 克隆測序

以洛浦縣采集疑似病毒病的樣品cDNA為模板做PCR，將PCR產(chǎn)物參照柱式DNA切膠回收試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)說明書進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定的3個陽性單克隆送至公司進(jìn)行測序(華大基因公司)。

1.2.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹

將測序得到的核酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，并下載相似性較高的序列。將之前在文獻(xiàn)報(bào)道的序列作為分類標(biāo)準(zhǔn)，以萵苣褪綠病毒(Lettucechlorosisvirus, LCV)的基因作為外群[19]，系統(tǒng)進(jìn)化樹采用MEGA5.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining method)進(jìn)行5 000次Bootstrap重復(fù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCYV感染洛浦縣甜瓜的癥狀

研究表明，中國新疆南疆甜瓜葉片具有明顯的黃化現(xiàn)象，葉片葉肉開始退綠，而后黃化，向上發(fā)展，逐漸黃化，嚴(yán)重時(shí)整株黃化，但葉脈仍為綠色。大棚里甜瓜被CCYV感染的典型特征。圖1

注：A和B：大棚里的甜瓜被CCYV感染的早期癥狀；C：大棚里的甜瓜被CCYV感染的中期癥狀；D：大棚里的甜瓜被CCYV感染的晚期癥狀

2.2 RT-PCR檢測CCYV

研究表明，51份甜瓜樣品中，只有洛浦縣樣品中可以看到預(yù)期大小相符的條帶，洛浦縣的13份樣本中，8份檢出為CCYV陽性，檢出率為61.53%，而中國新疆巴楚縣、阿克蘇市、莎車縣、伽師縣、疏勒縣、疏附縣未檢出CCYV。圖2

注：泳道M：2 000的DNA marker；泳道-：陰性對照；泳道1～23：51份樣本的一部分，其中泳道15-23表示洛浦縣的部分樣本

2.3 洛浦縣CCYV分離物核酸序列

研究表明，以中國新疆洛浦縣陽性樣本的cDNA為模板PCR擴(kuò)增、克隆測序后，獲得了685 bp的核酸序列。與CCYV分離物的CP基因的最高一致性(identity)為100%，即與來自日本(YP_006522431.1)、黎巴嫩(AGT56730.1、AGT56731.1、AGT56734.1)和QDQ37124.1的CCYV分離物CP基因的一致性均為100%，中國新疆洛浦縣的該病毒為CCYV。表1

表1 與GenBank一致性較高的部分CCYV序列

2.4 洛浦縣CCYV分離物的進(jìn)化

研究表明，所有分離物分類成3個組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。在Bootstrap值很高(98)的水平上，研究所得中國新疆洛浦縣CCYV分離物的CP基因與1個蘇丹分離物(JF807053)、3 個日本分離物(AB523789、NC018174、XP-006522431)、3個塞浦路斯分離物(LT992909、LT992910、LT992911)、9個黎巴嫩分離物(KC990504、JX014262、KC990505、KC990506、KC990507、KC990508、KC990503、AGT56730、AGT56731)和11個國內(nèi)分離物(KJ735450、HM581658、KX118632、KP896506、JF502222、KY400632、KY400633、KY400634、JQ904629、KU507602、KJ149806)的CP基因聚在I組(Group I)，進(jìn)行分析的分離物來源是不同國家，但具有很高遺傳距離，且不同地區(qū)遺傳差異很小。在Bootstrap值99的水平上，沙特阿拉伯的8個分離物(ALN96446, KT946811、KT946809、KT946816、KX120124、KX120123、KX120122、KX120121)聚在Ⅱ組。在Bootstrap值99的水平上，伊朗的3個分離物(KC577203、KC577202、KC577201)聚在Ⅲ組。中國新疆洛浦縣分離物在進(jìn)化上與其他地區(qū)的分離物存在較高親緣性，變異很小。圖3

注：系統(tǒng)進(jìn)化樹運(yùn)用MEGA5.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建，Bootstrap值是5 000次重復(fù)；●表示研究測序所得到的序列

3 討 論

CCYV主要由B型和Q型煙粉虱以半持久性方式傳播[14-16]。CCYV在瓜類作物上的發(fā)生與傳播媒介煙粉虱的群體種類和數(shù)量存在密切關(guān)系[14]，2011年報(bào)道Q型煙粉虱侵入中國新疆[20]之后，2013年在中國新疆石河子市、博樂市、岳普縣、澤普縣、葉城縣、莎車縣、墨玉縣、和田市、阿克蘇市、哈密市、鄯善縣、烏魯木齊市、克拉瑪依市、伊寧市、吐魯番市和庫爾勒市等地發(fā)現(xiàn)煙粉虱[17]。2016年報(bào)道吐魯番發(fā)現(xiàn)CCYV侵害哈密瓜[18]，但南疆瓜區(qū)未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)2019年在中國新疆南疆甜瓜種植區(qū)晚熟瓜和復(fù)播甜瓜上發(fā)生葉片黃化癥狀，研究只對南疆7個縣/市具有黃化癥狀的甜瓜葉片進(jìn)行CCYV病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)只有洛浦縣檢測到CCYV，且檢測率達(dá)到59.57%，但該病毒在和田、喀什和阿克蘇地區(qū)的其它縣沒有發(fā)現(xiàn)待進(jìn)一步深入的研究。研究測序得到的洛浦縣CCYV序列與GenBank上的甜瓜CCYV分離物的CP基因的一致性達(dá)到100%，2019年在洛浦縣甜瓜種植區(qū)葉片上發(fā)生大面積導(dǎo)致黃化癥病毒是CCYV，CCYV在洛浦縣甜瓜區(qū)普遍發(fā)生。在中國新疆甜瓜主產(chǎn)區(qū)需要對煙粉虱進(jìn)行監(jiān)測和控制，有效防治CCYV。

CCYV基因組結(jié)構(gòu)2010年才被揭示[1]，2016年，彭斌等[11]報(bào)道在中國新疆吐魯番發(fā)現(xiàn)CCYV，且獲得其分離物的全基因組序列，分析的分子變異和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，中國吐魯番CCYV分離物與中國其他省以及周圍國家的CCYV分離物聚為同一組，CCYV的分子變異很低[11]。研究中，基于CP基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，中國新疆洛浦縣CCYV分離物與中國新疆(吐魯番)、蘇丹、日本、塞浦路斯、黎巴嫩、聚在同一組中國的CP基因，這些地區(qū)雖然存在一定的地理分化，但遺傳變異很低，結(jié)果與彭斌等[11]研究新疆吐魯番CCYV的結(jié)果一致，可能屬于同一來源，病毒初始來源單一，也可能是遺傳變異低的原因之一。

4 結(jié) 論

從中國新疆巴楚縣、阿克蘇市、莎車縣、伽師縣、疏勒縣、疏附縣采集的疑似甜瓜病毒病的樣本中均未發(fā)現(xiàn)CCYV，只在中國新疆洛浦縣發(fā)現(xiàn)CCYV，在洛浦縣的檢測率達(dá)到59.57%，且對洛浦縣甜瓜生產(chǎn)造成危害。中國新疆洛浦縣分離物與中國其他省區(qū)、日本、黎巴嫩、黎巴嫩、沙特阿拉伯、黎巴嫩等地區(qū)的CCYV分離物具有很高一致性，CCYV中國新疆洛浦縣分離物與來自中國其它省和我國周圍國家分離物親緣關(guān)系很近，且變異很低。