耐輻射絲狀真菌F161的分離鑒定及其對鍶的吸附特性

張麗娟，唐琦勇，謝玉清，顧美英，王 博，朱 靜，宋素琴，黃 偉，張志東，王 瑋

(新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】放射性污染是一類特殊污染[1]。90Sr是鍶元素一種具放射性的同位素，是鈾的裂變產(chǎn)物之一，可做β射線的放射源，半衰期為28.8年[2]。利用特殊的生物富集和固定放射性污染物的生物修復法具有優(yōu)勢，特別是微生物修復，其成本低且適于大面積修復[3]。為適應生存環(huán)境進化出特殊的性質(zhì)，污染環(huán)境和極端環(huán)境中存在的微生物，對污染環(huán)境具有一定修復能力，尤其是在輻射污染區(qū)這一特殊污染環(huán)境的微生物，這為利用微生物修復放射性污染奠定了基礎?！厩叭搜芯窟M展】細菌、酵母菌、真菌及藻類對金屬離子尤其是重金屬離子具有良好的吸附效果[4-11]，工業(yè)酵母菌開展吸附特征的研究發(fā)現(xiàn)，菌體吸附液相中90%以上的Sr2+[12]。趙玉連等[13]研究40株土壤常駐細菌，發(fā)現(xiàn)近1/4菌株對Sr2+去除效率在70%～100%。廖上強等[14]研究了1株伯克霍爾德菌對放射性銫的耐受和吸附，液體培養(yǎng)基中的銫去除率達到58.77%?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外開展真菌對核素尤其是放射性核素吸附試驗的研究報道相對較少。鐮刀真菌F54對放射性銫137Cs的吸附率達到62%。研究耐輻射絲狀真菌F161的分離鑒定及其對鍶的吸附特性?！緮M解決的關鍵問題】研究1株來自于放射性污染區(qū)的土著真菌對Sr2+的吸附作用，為放射性污染的治理提供一些新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200.0 g切成小塊，葡萄糖20.0 g，去離子水1 000 mL，115℃滅菌30 min。

分析純SrCl2配制成Sr2+濃度為2 000 mg/L的儲備液，置于100 mL試劑瓶中備用。其余試劑皆為市售分析純。分析用水為超純水。

Xseries Ⅱ型電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)，美國Thermo公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株F161的分離、純化

于新疆某放射性污染地區(qū)采集土樣。以不同的培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)基為富集條件，采用平板培養(yǎng)法篩選出一批生長良好的微生物菌株，平板劃線法純化菌株。優(yōu)選出1株編號為F161的菌株。通過水壓片和插片法顯微鏡下觀察其菌絲和產(chǎn)孢形態(tài)。參照《真菌鑒定手冊》對菌株進行形態(tài)學鑒定。純化后的菌株用PDA固體培養(yǎng)基斜面4℃保存。

1.2.2 菌株F161的分子鑒定

用試劑盒Genview?GV-Filamentous Fungi Genomic DNA Extraction Kit提取菌株基因組DNA。用通用引物ITS1、ITS4擴增ITS序列，用NSI、fung引物擴增18S序列，用PenF1、AspR1引物擴增細胞色素氧化酶I亞基基因cox1序列，用AD3和Q1引物擴增鈣調(diào)蛋白基因序列，用IN2和Bt2引物擴增β-微管蛋白基因序列，PCR 擴增反應體系為50 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行測序，序列提交GenBank。

測序結果用Blast搜索軟件在GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫中進行同源比較，選取相似性較高的標準菌株的基因序列，用ClustalX 2.0進行多序列比對，用MEGA 5.0軟件采用Saitou和Nei的鄰接法(Neighbor Joining)構建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值1 000。表1

表1 PCR擴增引物序列

1.2.3 菌株F161 生理生化及BIOLOG碳源利用

溫度、pH等不同條件對菌株F161生長的影響實驗，在PDA瓊脂固體培養(yǎng)基上進行。

菌株F161 BIOLOG碳源利用實驗，參照姚粟等[18]方法，采用75% T/FF-IF的濁度標準液，將菌株純培養(yǎng)物制成菌懸液，倒入加樣槽中，使用八道電動移液器，將其接種于Biolog FF鑒定微平板的96孔中，接種量為每孔100 μL。接種后的FF鑒定微平板在30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、48、76和96 h，讀取微平板。

1.2.4 菌株F161生長過程中對Sr2+的吸附特性

取20 mL無菌水與新鮮的F161 PDA斜面均勻混合為菌種懸濁液。配制PDA培養(yǎng)基100 mL(含有SrCl2，終濃度為20 mg/L)于500 mL錐形瓶中。接種0.3 mL 菌懸液，180 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣1 mL。樣品經(jīng)10 000×g離心5 min，上清液用ICP-MS測定Sr2+濃度。取樣后剩余的培養(yǎng)物經(jīng)真空抽濾至無液體，所得菌體用于計算生物量。設置3個重復，以不接菌的PDA液體培養(yǎng)基作為對照。

單位吸附量和吸附率的計算：

用單位吸附量(qe)和吸附率(R)表征微生物對Sr2+的吸附情況，計算方法式(1)、(2)中。

(1)

(2)

式中，C0為溶液中Sr2+的初始濃度，mg/L；Ct為吸附t時間后溶液中Sr2+的濃度，mg/L；V為吸附溶液體積，L；m為菌株F161的菌體質(zhì)量，g。

1.2.5 菌體量、吸附時間對F161菌體直接吸附Sr2+的影響

分別稱取不同質(zhì)量的新鮮F161菌體(0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2和1.5 g)置于15 mL Sr2+濃度為20 mg/L的溶液體系內(nèi)，28℃吸附過夜，取菌懸液離心，經(jīng)ICP-MS測定上清液的Sr2+濃度。

稱取0.5 g菌體，分別震蕩懸浮于Sr2+濃度為20 mg/L的10 mL溶液體系內(nèi)，28℃每間隔1 h取樣。樣品經(jīng)ICP-MS測定上清液最終Sr2+濃度。

所有試驗均設置3個重復。

1.2.6 菌株F161耐受輻射、重金屬能力及吸附放射性90Sr的能力測定

菌株F161培養(yǎng)物γ輻射耐受特性以Ferreira等已建立的方法做驗證[19]。菌株F161接種于液體PDA培養(yǎng)基內(nèi)，180 r/min，28℃搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，4℃離心收集菌體，以生理鹽水洗滌并重新懸浮。放射源60Co以0.167 kGy/min的劑量率在室溫下進行照射。照射劑量以2.0 kGy的幅度從0 kGy升到16.0 kGy。照射后的樣品稀釋涂布至PDA平板上，28℃靜置培養(yǎng)3～5 d后觀察是否生長，以檢測F161對于γ輻射的耐受特性。每個輻照劑量設置3個重復。

將F161菌種接種含重金屬離子的PDA固體培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)72 h，觀察菌落的生長情況。實驗用重金屬離子為Cr2+、Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+，PDA培養(yǎng)基中的最終濃度梯度設置為50、100、200和500 mg/L。同時按2%接種量分別接種對應濃度重金屬離子的PDA液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，觀察液體中菌絲球的生長情況。

在PDA液體培養(yǎng)基中加入1 mL(1 805.5 bq)放射性90Sr母液，按2%接種量接種真菌F161，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，收集樣品，離心去除菌體，收集上清。采用液閃檢測儀測定上清液中放射性90Sr的放射活度。設置3個重復。

放射性鍶的吸附率的計算方法：

(3)

式中，℃為溶液中放射性Sr的初始放射性活度，bq；Ct為吸附t時間后溶液中放射性Sr的放射性活度，bq。

2 結果與分析

2.1 菌株 F161的分離純化及鑒定

研究表明，在PDA瓊脂平板上初生菌落白色，絨毛狀，向外擴展快，隨著培養(yǎng)時間菌落先呈現(xiàn)淡粉紫色后期由邊緣開始逐漸變青色，最終菌落呈青色，質(zhì)地絨粉狀，有同心圓環(huán)。分生孢子梗從氣絲垂直生出，無厚壁足細胞。分生孢子梗有隔不分枝，光滑，在略膨大的頂端對稱排列著單居瓶狀小梗，小梗上著生鏈狀分生孢子，孢子橢圓形，表面光滑帶有土黃的雜綠色。根據(jù)以上形態(tài)特征，鑒定該菌株為屬于子囊菌亞門，不整囊菌綱，散囊菌目，散囊菌科，青霉屬的1個種，屬于青霉屬(Penicilliumsp.)。圖1

圖1 F161的菌落形態(tài)(a)(b)和顯微鏡下形態(tài)(c)(d)(10×20倍)

菌株F161的最適宜培養(yǎng)溫度是28～30℃，最適pH 7.0，最適培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，最適宜NaCl濃度為2%～4%，最適宜KCl濃度為2%～4%，最適宜MgCl2濃度為1%～2%。F161可利用以下26種碳源：熊果苷、糊精、赤藻糖醇、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸鹽、丙三醇、D-核糖、水楊苷、D-木糖、γ-氨基丁酸、 ?-羥基丁酸、奎尼酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、鳥氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-蘇胺酸、2-氨基乙醇、腺苷-5’-磷酸鹽。Biolog FF鑒定板的數(shù)據(jù)經(jīng)系統(tǒng)判讀比對，菌F161的碳源代謝特征與草酸青霉PenicilliumoxalicmCurrie&Thom同源性最高，SIM值為0.432。 表2

表2 不同條件下菌株F161的生長

將菌株的ITS、18S、cytochrome c oxidase subunit 1、Calmodulin、β-tublin基因序列上傳Genbank。通過序列比對， ITS 基因序列(Genbank No. MN818666)比對后與P.oxalicumsstrain WZ-119多株菌同源性達100%。18S基因序列(Genebank No. MT233418)通過比對，與P.oxalicumstrainTGQM01等多株P.oxalicum菌同源性為100%。Calmodulin基因序列比對后菌株與PenicilliumoxalicumstrainITEM7573同源性最高(99.80%)。cox1基因序列比對后與P.oxalicumvoucher226606同源性100%同源性100%。β-tublin序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對后，與P.oxalicumstrainCGMCC 3.18171同源性100%。菌株F161為青霉屬草酸青霉種P.oxalicum。圖2～4

圖2 基于cox1基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

圖3 基于鈣調(diào)蛋白基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

圖4 基于β微管蛋白基因序列的菌株F161(Penicillium sp.)系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

2.2 菌株F161生長過程中對Sr2+的吸附以及pH對菌株F161吸附Sr2+的影響

研究表明，28℃、pH 7.0 的生長條件下，培養(yǎng)基中Sr2+的初始濃度為20 mg/L，F(xiàn)161菌對Sr2+的吸附率隨著時間而急速增長，在48 h左右達到最高值，吸附率在36.67%左右，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h吸附率隨時間變化不大，96 h后濕菌重量和吸附率開始有回升的趨勢。圖5

圖5 青霉(Penicillium sp.) F161在20 mg/L Sr2+壓力下生長曲線及吸附特性

選擇pH 4.0～9.0作為初始的pH，180 r/min，28℃搖床培養(yǎng),測定F161菌對Sr2+的吸附率。取樣經(jīng)ICP-MS檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的初始pH對生長吸附的影響較大，pH 4～6時，隨著pH的增加，吸附率明顯上升，在pH 6.0時，吸附率最高89.42%，pH 6～8時，吸附率隨著pH升高而緩慢下降。圖6

圖6 不同pH下青霉(Penicillium sp.)F161生長吸附Sr2+變化

2.3 菌體量、吸附時間對F161菌體直接吸附Sr2+的影響

研究表明，在以新鮮菌體為材料進行吸附時，在15 mL Sr2+濃度為20 mg/L的溶液體系內(nèi)，隨著菌體量的增加，吸附率逐漸上升至峰值17.31%后基本穩(wěn)定，不再隨菌體量的增加而增加。單位菌體吸附量在最初達到最高0.23 mg/g后，隨菌體量的增加逐漸降低。

吸附時間對于菌體吸附的影響：稱取0.5 g菌體，均勻懸浮于Sr2+濃度為20 mg/L的10 mL溶液體系內(nèi)，間隔1 h取樣。樣品經(jīng)ICP-MS測定，菌體吸附率遠遠低于生長吸附，隨著時間的增加吸附率并沒有顯著增加，只是在一定的值范圍上下波動。圖7

圖7 不同菌體添加量(a)、吸附時間(b)下青霉(Penicillium sp .)F161菌體吸附Sr2+變化

2.4 菌株F161的耐受輻射、耐受重金屬的能力及其對放射性90Sr的吸附

研究表明，菌株F161菌體經(jīng)放射源60Co以0.167 kGy/ min的劑量率在室溫下進行照射，照射劑量達到16.0 kGy時，照射后的菌體仍能在PDA平板上生長，F(xiàn)161能夠耐受高達16Gry的γ輻射。

耐輻射青霉(Penicilliumsp .)F161對Pb2+、Zn2+、Ni+、Co2+、Cr2+、Hg2+等6種重金屬均具有很高的耐受性，其中對Pb2+、Cr2+的耐受濃度最大，均可達500 mg/L；對Co2+、Hg2+、Zn2+的耐受性次之，均可達100 mg/L。

F161對放射性90Sr吸附率達到49.45%。圖8

圖8 F161對不同金屬離子的耐受

3 討 論

微生物是地球上分布最廣的生物，體積小，表面積大，繁殖快，適應能力強，可用于各類污染環(huán)境的治理和修復[20-22]。研究篩選獲得的絲狀真菌F161，產(chǎn)生青霉屬典型的帚狀的分生孢子，通過多個保守基因的序列比對分析，均與草酸青霉種同源性最高。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察結合分子生物學鑒定，菌株F161為1株草酸青霉，最適宜培養(yǎng)溫度是28～30℃，最適pH 7.0。Biolog試驗表明，菌株F161可以利用26種碳源。根據(jù)前人報道，草酸青霉具有多種生物活性，能夠產(chǎn)生有機酸活化土壤磷[23]，強化土壤有機質(zhì)分解[24]，改良土壤提高肥力。在污染治理方面，用草酸青霉處理高鹽Cr(VI)廢水和吸附重金屬離子[25,26]，然而其對于放射性核素方面的研究相對較少。

利用微生物修復放射性污染，所選擇的微生物必須有一定輻射耐受性；不能產(chǎn)生2次污染[27,28]。目前，已經(jīng)有利用耐輻射異球菌Deinococcusradiodurans生物膜的新型鈾生物修復方法的報道[29]，前期研究也發(fā)現(xiàn)了一些既有輻射抗性，又對放射性核素具有吸附特性的微生物，如曲霉F77、鏈孢霉F54[30-31]。研究中菌株F161能夠耐受10 Gry的輻射劑量，對放射性90Sr具有較好的吸附作用，吸附率49.45%，同時對多種重金屬離子(Cr2+，Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+)具有很好的耐受性。

微生物通過吸附、富集、轉(zhuǎn)化、降解等作用轉(zhuǎn)化或去除環(huán)境中的重金屬和放射性核素污染物[32-33]。對輻射污染的治理基本都是利用微生物富集吸附核素的特性，如Myxococcusxanthus和Aspergillusfumigatus都能吸附核素鈾[34]，釀酒酵母能吸附核素鈾、鍶和銫[35]。在吸附溫度28℃、初始pH 7.0、Sr2+的初始濃度為20 mg/L條件下，F(xiàn)161生長曲線與吸附曲線基本吻合，二者在48 h達到峰值36.37%，此后隨著菌體的老化、自溶，吸附率略有下降。這主要是由于隨著菌絲體生長進入穩(wěn)定期，細胞對Sr2+的吸附逐漸達到飽和。隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物對Sr2+的吸附率略有降低，表明隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌體開始死亡，甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，打破固液吸附平衡，造成菌體吸附率下降。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液初始pH對菌的吸附效果產(chǎn)生明顯的影響，發(fā)現(xiàn)pH 6.0是F161生長吸附的最佳初始pH，微酸性環(huán)境有利于Sr2+的吸附，得到F161對Sr2+的最高吸附率89.42%。

在對粘球菌、曲霉、酵母的放射性核素吸附研究中，多是以菌體作為材料來做研究的[34,35]。研究嘗試建立以F161新鮮菌體為材料的吸附體系，發(fā)現(xiàn)菌體的吸附率遠低于生長吸附。隨著菌體添加量的增加，吸附率逐漸上升至峰值17.31%后基本穩(wěn)定，不再隨菌體量的增加而增加。單位菌體吸附量在最初達到最高0.23 mg/g后，隨菌體量的增加逐漸降低。隨著取樣時間的延伸，菌體吸附率只是在一定的值范圍上下波動，吸附可能在菌體添加的最初短時間內(nèi)完成的。

4 結 論

4.1 土著真菌F161經(jīng)鑒定為草酸青霉。該菌最適宜培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最適宜生長溫度28～30℃，最適宜pH 7.0。F161能耐受 10 Gry輻射劑量，對重金屬離子Cr2+、Zn2+、Co2+、 Pb2+、Hg2+具有很好的耐受性，可一邊生長一邊吸附積累90Sr。

4.2 在吸附溫度28℃、初始pH 7.0、Sr2+的初始濃度為20 mg/L震蕩培養(yǎng)條件下，F(xiàn)161生長過程中，隨著菌體量的增加，吸附率也在增加，二者曲線基本溫和，48 h達到峰值36.67%，培養(yǎng)基的初始pH對生長吸附的影響較大，pH 6.0時獲得該菌對Sr2+的最高吸附率89.42%。

4.3 直接利用新鮮菌體材料吸附溶液中的Sr2+效果遠差于伴隨成長過程的吸附，F(xiàn)161新鮮菌體對Sr2+的吸附率并不隨著吸附時間的延長而增加。

4.4 F161是1株對放射性核素污染具有修復能力的土著絲狀真菌，在有較高的重金屬離子混合污染的放射性環(huán)境中具有一定的修復應用潛力。