患病龍蝦病原檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)

○姚方艷

2020年，我縣歸仁鎮(zhèn)3個(gè)塘口的養(yǎng)殖戶龍蝦塘口出現(xiàn)了死亡的現(xiàn)象，病蝦主要表現(xiàn)為頭胸甲易剝離、螯肢及附肢無(wú)力、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激能力較弱，在頭胸甲部位常出現(xiàn)白斑。筆者通過(guò)對(duì)病蝦肝胰腺的細(xì)菌分離及鑒定和對(duì)蝦鰓的白斑病毒的提取及PCR法分子檢測(cè)技術(shù)來(lái)探討引起小龍蝦發(fā)病的原因。

1 方法

1.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

（1）病原菌的分離：用滅菌棉簽蘸取小龍蝦肝胰腺，均勻涂于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和TCBS培養(yǎng)基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h后，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個(gè)菌落劃線接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h。

（2）細(xì)菌的鑒定：把分離出的細(xì)菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。

（3）藥敏試驗(yàn)：挑取單菌落于5mL生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海ˋ管），從中吸取0.1mL，加入到10mL無(wú)菌生理鹽水中混勻（B管）。利用微量移液器吸取B液，加入藥敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分別測(cè)定細(xì)菌分離株對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉共7種常見(jiàn)藥物的敏感程度。蓋好試劑板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度。

1.2 WSSV核酸提取及檢測(cè)：

從病蝦中取約100 mg鰓組織，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行DNA提取，對(duì)WSSV DNA樣本采用《GB/T 28630.2-2012白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測(cè)法》為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系總量為50μL，分別為：25μL Mix Taq酶（Takara），18μL 無(wú)菌水，1 μL 正向引物，1 μL反向引物，5 μL模板。PCR產(chǎn)物通過(guò)用50×TAE電泳緩沖液配制的1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 病原菌鑒定

通過(guò)細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)從病蝦肝胰腺分離出的細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定結(jié)果為腸棕氣單胞菌、最小弧菌和霍亂弧菌。

2.2 病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3株細(xì)菌對(duì)7種抗菌藥物的最小抑菌濃度如下表所示。

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，腸棕氣單胞菌、最小弧菌、霍亂弧菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。

3株細(xì)菌對(duì)7種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對(duì)照表（單位：μg/mL）：

2.3 WSSV PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示病蝦WSSV病毒陽(yáng)性檢出率為100%，如下圖所示。

WSSV PCR檢測(cè)結(jié)果

M：DNA Marker（自上到下依次為2000、1000、750、500、250、100bp）；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3.采樣編號(hào)SH20052601；4.采樣編號(hào)4SH2005260202；5.采樣編號(hào)SH20052603

3 討論與分析

從發(fā)病小龍蝦肝胰腺分離到的3個(gè)細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法，確定為腸棕氣單胞菌、最小弧菌和霍亂弧菌。通過(guò)藥敏試驗(yàn)表明三種細(xì)菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。

PCR結(jié)果表明生病小龍蝦中都感染了WSSV（白斑綜合征病毒），目前尚無(wú)有效的治療藥物。在養(yǎng)殖過(guò)程中如果出現(xiàn)死蝦，在遠(yuǎn)離養(yǎng)殖塘處掩埋病蝦，及時(shí)售賣池塘中的龍蝦，既可降低養(yǎng)殖密度，也可以降低損失；對(duì)于捕到地籠里的龍蝦不可回塘。

資金項(xiàng)目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（克氏原螯蝦）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（JATS〔2020〕297）

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