維生素C對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)及非特異性免疫機(jī)能的影響

田立立，萬金娟，孟祥龍，周梓涵，孫龍生*，唐建清

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

“十三五”以來，小龍蝦（學(xué)名克氏原螯蝦，Procambarus clarkii）產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，2019年我國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)128.66萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)208.96萬t，總產(chǎn)值突破4 000億元大關(guān)[1]。其中稻蝦綜合種養(yǎng)占86%，已經(jīng)成為小龍蝦生態(tài)健康養(yǎng)殖的主流模式。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，小龍蝦養(yǎng)殖密度大，水體殘餌糞便累積較多，水質(zhì)難以控制，尤其是小龍蝦池塘水草豐富，水體晝夜pH值變化大，再加上不穩(wěn)定的氣候條件以及相互蠶食的習(xí)性等因素，小龍蝦機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致疾病頻發(fā)，生長(zhǎng)緩慢，甚至出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來促進(jìn)克氏原螯蝦生長(zhǎng)，提高抗病力、免疫力已成為研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)［3］研究表明，維生素C（Vc）具有促進(jìn)克氏原螯蝦幼蝦生長(zhǎng)，提升機(jī)體免疫力和成活率的作用。Fuertes等[4]認(rèn)為，飼料中不同Vc水平（0、0.2、0.4和0.8 g/kg）對(duì)克氏原螯蝦存活率沒有顯著影響，但0.2 g/kg組的克氏原螯蝦機(jī)體生長(zhǎng)最為顯著，且餌料系數(shù)明顯降低。有關(guān)克氏原螯蝦對(duì)Vc的適宜需要量以及Vc影響蝦的成活與生長(zhǎng)的生理機(jī)制尚未清楚。該試驗(yàn)旨在探討飼料中添加不同水平Vc對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長(zhǎng)及免疫機(jī)能的影響，為進(jìn)一步明確克氏原螯蝦對(duì)Vc的適宜需要量提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇規(guī)格基本一致、活力好、附肢健全、初始體質(zhì)量為（3.19±0.06）g的克氏原螯蝦幼蝦540尾，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，放入18個(gè)循環(huán)流水水泥池中養(yǎng)殖（2 m×2 m×0.8 m），每個(gè)水泥池放養(yǎng)30尾，同時(shí)配套遮陽(yáng)與隱蔽設(shè)施。

1.2 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕為蛋白源，豆油為脂肪源，并補(bǔ)充礦物質(zhì)、維生素等，在此基礎(chǔ)上添加不同水平的維生素C，配制6組等氮等能飼料，見表1。飼料中維生素C（95%包膜維生素C，羅氏公司）的添加量為：0、30、60、120、240和480 mg/kg。試驗(yàn)飼料委托安徽新希望飼料有限公司加工制作，每組飼料2 t/批次，選取中間部分的飼料，50℃烘干后置于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平①（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

克氏原螯蝦幼蝦在水泥池暫養(yǎng)14 d后正式開始投喂試驗(yàn)飼料，每天投喂2次（07：30—08：30和18：30—19：30）。初始日投餌量為蝦體質(zhì)量的3%，后期根據(jù)攝食和生長(zhǎng)情況適當(dāng)調(diào)整，以投餌后1 h內(nèi)吃完為宜。飼養(yǎng)期間水溫21.9～27.5℃，pH值7.8～8.5，ρ（溶解氧）>6 mg/L，ρ（氨氮）<0.04 mg/L，ρ（硫化氫）<0.01 mg/L，ρ（亞硝酸鹽）<0.01 mg/L，試驗(yàn)期間07：30—18：30打開遮陽(yáng)網(wǎng)，每日觀察蝦攝食及死亡情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈出并稱重計(jì)數(shù)，分析死亡原因。試驗(yàn)期60 d。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，對(duì)各水泥池的克氏原螯蝦分別進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，以計(jì)算存活率和增重率。冰浴麻醉后進(jìn)行蝦體的解剖，每個(gè)水泥池隨機(jī)選取3尾蝦（每組9尾蝦），先抽血淋巴，然后采集肌肉、肝胰腺并稱重。另隨機(jī)采集3尾蝦的肝胰腺，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，待測(cè)定免疫相關(guān)指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

（1）生長(zhǎng)指標(biāo)。分別按下式計(jì)算增重率（WGR）、成活率（SR）、肥滿度（CF）、含肉率（MF）、肝胰腺指數(shù)（HSI）、飼料系數(shù)（FCR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）等指標(biāo)。

增重率（%）=（M1×M0）/M0×100%

成活率（%）=N1/N0×100%

飼料系數(shù)=Mf（/M1×M0）

特定生長(zhǎng)率（%/d）=（ln M1×ln M0）（/T1-T0）×100%

含肉率（%）=Mj/M1×100%

肥滿度=M1/Lt3×100%

肝胰腺指數(shù)=Mg/M1×100%

式中：M1，M0——分別為終末平均質(zhì)量、初始平均質(zhì)量，g；

Mf——飼料攝入量，g；

Mj、Mg——分別為肌肉重、肝胰腺重，g；

N1、N0——分別為終末尾數(shù)、初始尾數(shù)，尾；

L1——終末均體長(zhǎng)，cm；

T1、T0——試驗(yàn)開始時(shí)間、結(jié)束時(shí)間，d。

（2）血液免疫指標(biāo)。用1 mL無菌注射器（含抗凝劑）從螯蝦頭胸甲腹側(cè)取血淋巴，注入無菌1.5 mL離心管中，使血液與抗凝劑最終比例為1∶1，低溫離心（4℃，3 000 r/min）10 min（分離血漿和血細(xì)胞），取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?，用于血液免疫指?biāo)（溶菌酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶）的測(cè)定。

（3）肝胰腺抗氧化相關(guān)指標(biāo)。將采集的肝胰腺用生理鹽水沖洗干凈，然后按1∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水，冰浴勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液置于新的離心管待測(cè)。所有上清液先用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)其蛋白濃度后再測(cè)其他抗氧化指標(biāo)。肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（One Way ANOVA），多重比較采用Duncan法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±Std）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平設(shè)定為P<0.05，表中同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同，表示組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響見表2。由表2可見，120 mg/kg Vc試驗(yàn)組蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于其他各組（P<0.05）；480 mg/kg Vc組蝦的含肉率顯著高于其他各組（P<0.05）；各組間克氏原螯蝦其余生長(zhǎng)指標(biāo)未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P<0.05）。

表2 維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

2.2 飼料中維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦血液免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦血液免疫指標(biāo)的影響見表3。由表3可見，120 mg/kg Vc試驗(yàn)組血清溶菌酶顯著高于其他各組（P<0.05），而其他試驗(yàn)組間則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P>0.05）；120和480 mg/kg Vc試驗(yàn)組血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P>0.05），卻顯著高于其他4組（P<0.05）。

表3 維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦血液免疫指標(biāo)的影響

2.3 維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響見表4。由表4可見，120 mg/kg Vc組蝦的肝胰腺過氧化氫酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），其他試驗(yàn)組間則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P>0.05）；飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性沒有顯著影響（P>0.05）；飼料中未添加維生素C組肝胰腺M(fèi)DA含量顯著高于各添加組（P<0.05）；120 mg/kg Vc試驗(yàn)組MDA含量顯著低于其他組（P<0.05）。

表4 維生素C添加水平對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

3 討論

3.1 維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

維生素C作為一種水溶性維生素具有重要營(yíng)養(yǎng)作用。邵光明等[5]報(bào)道，飼料中添加0.02%維生素C可顯著提高克氏原螯蝦的增重率，促進(jìn)生長(zhǎng)。甲殼動(dòng)物體表硬化層由一種外殼蛋白和苯醌經(jīng)交聯(lián)作用而成，維生素C可通過影響苯醌的形成起到促進(jìn)蝦蟹蛻殼的作用，由此促進(jìn)蝦蟹的生長(zhǎng)[6]。該試驗(yàn)中，維生素C對(duì)克氏原螯蝦的存活率和飼料利用狀況并無顯著影響，但隨著飼料中維生素C水平的提高，增重率和特定生長(zhǎng)率呈先上升而后下降的趨勢(shì)。侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）幼蟹上也得出了類似的結(jié)論。由此表明，飼料中添加適量的維生素C（120 mg/kg）對(duì)克氏原螯蝦具有顯著的促生長(zhǎng)作用，但是維生素C過量時(shí)增重率和特定生長(zhǎng)率反而下降，可能過量的維生素C產(chǎn)生毒害作用抑制機(jī)體生長(zhǎng)。左迪[8]對(duì)紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）的研究結(jié)果表明，飼料中維生素C的添加量為0～400 mg/kg時(shí)，蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著上升。不同研究結(jié)果存在差異的原因可能與研究的物種、維生素C添加形式不同有關(guān)。

目前，關(guān)于維生素C對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物含肉率影響的研究鮮有報(bào)道，含肉率是評(píng)價(jià)魚蝦生產(chǎn)性能及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要指標(biāo)[9]。在該試驗(yàn)中，當(dāng)飼料中維生素C添加量為480 mg/kg時(shí)克氏原螯蝦的含肉率顯著提高，這表明一定量的維生素C可促進(jìn)克氏原螯蝦肌肉的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中克氏原螯蝦含肉率最高為480 mg/kg Vc組（15.36±1.10）%，遠(yuǎn)低于洞庭湖中的20.21%[10]以及貴州湄潭稻田養(yǎng)殖的18.40%[11]，但高于水族箱養(yǎng)殖的12.83%[12]。造成差異的原因可能與初始規(guī)格、發(fā)育階段、養(yǎng)殖模式、自然環(huán)境、水質(zhì)條件、飼料組成等的差異有關(guān)[13]。

3.2 維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦血漿免疫機(jī)能的影響

甲殼動(dòng)物的免疫防御系統(tǒng)屬于非特異性免疫系統(tǒng)，除了SOD等抗氧化指標(biāo)外，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等也是重要的非特異性免疫指標(biāo)，被廣泛地用來評(píng)價(jià)蝦類的健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[14]。

作為非特異性免疫生物防御因子，溶菌酶具有溶菌活性，并可以誘導(dǎo)其他免疫因子的合成和分泌[15-16]。ACP和AKP是蝦蟹重要的非特異性磷酸水解酶[17]，直接參與磷酸基團(tuán)的代謝和物質(zhì)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)，可形成水解酶體系消除病原異物，與機(jī)體的生長(zhǎng)存活息息相關(guān)。在血細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包囊反應(yīng)中會(huì)伴有ACP的釋放，參與病毒或細(xì)菌的識(shí)別、吞噬、降解[18]。

在該試驗(yàn)中，當(dāng)飼料維生素C添加量為0～240 mg/kg時(shí)，克氏原螯蝦血漿AKP、ACP與LZM活性隨著飼料中維生素C添加水平的提高先上升后下降，這表明飼料中適量的維生素C能夠影響克氏原螯蝦的免疫防御機(jī)制，提高機(jī)體免疫活性和抗病力，而過量的維生素C導(dǎo)致一定的抑制作用，抵消部分免疫增強(qiáng)效用。隨著維生素C含量的進(jìn)一步增加，血漿AKP、ACP活性升高，這可能是機(jī)體的一種免疫補(bǔ)償機(jī)制。這與侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹幼蟹上的研究結(jié)果不一致，可能與試驗(yàn)對(duì)象的品種、養(yǎng)殖模式、生長(zhǎng)階段等不同有關(guān)，具體原因及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

抗氧化酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的幾種生物催化劑，是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠起到減緩氧化速度的作用，可將過氧化物轉(zhuǎn)換為毒害較低或無害的物質(zhì)，保護(hù)生物免受氧化損害[19]。SOD與CAT廣泛分布在生物體內(nèi)，可對(duì)產(chǎn)生的ROS進(jìn)行解毒，將H2O2分解為H2O和O2以避免細(xì)胞損傷和病變[20-21]，維持生物體的正常代謝和體內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量能夠反映出機(jī)體氧化損傷程度和清除自由基的能力[22]。因此，檢測(cè)蝦蟹組織中的SOD、CAT的活性和MDA含量的變化可以較為準(zhǔn)確地反映機(jī)體的抗氧化狀況。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性以飼料中維生素C含量120 mg/kg為拐點(diǎn)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而肝胰腺M(fèi)DA含量則隨著飼料中維生素C含量增加而呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，這說明飼料中適量的維生素C可有效提高克氏原螯蝦抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過氧化物MDA對(duì)機(jī)體的損害，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化功能，但進(jìn)一步增加維生素C含量則會(huì)損傷機(jī)體抗氧化系統(tǒng)。在該試驗(yàn)中，不同維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺SOD活性沒有顯著影響，與周歧存等[23]對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Prawns vannamei）的研究結(jié)果一致，可能是由于動(dòng)物體內(nèi)的兩大抗氧化體系協(xié)同作用，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮自由基清除作用。

4 結(jié)論

對(duì)克氏原螯蝦的適宜維生素C添加量為120 mg/kg，可顯著促進(jìn)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)，提高血漿LZM、AKP及ACP活性，同時(shí)提高克氏原螯蝦肝胰腺的抗氧化性能，降低MDA含量。若維生素C添加量繼續(xù)增加，則會(huì)導(dǎo)致克氏原螯蝦增重率及特定生長(zhǎng)率下降，降低免疫酶活力，這可能與維生素C過量使用導(dǎo)致的抑制作用有關(guān)。