miR-101靶向mTOR信號通路調(diào)控足細(xì)胞自噬在小鼠糖尿病腎病發(fā)病中的作用研究

胡玲，周樂汀，王思思，王涼，孫鑄興

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，江蘇 無錫 214023)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)的常見并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、腎功能不全，最后發(fā)展為終末期腎臟疾病[1]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在防止血漿蛋白滲漏方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，足細(xì)胞數(shù)量的減少以及結(jié)構(gòu)和功能的改變會嚴(yán)重破壞腎小球?yàn)V過屏障的完整性，促進(jìn)腎小球硬化，加速DN的進(jìn)展[2]。自噬作為真核細(xì)胞的固有生理功能，是細(xì)胞降解的重要方式，對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞存活至關(guān)重要。越來越多的研究表明，自噬是DN足細(xì)胞賴以生存、維持自身穩(wěn)態(tài)的重要保護(hù)機(jī)制[3]。在正常條件下，足細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的自噬活性，但DN足細(xì)胞的自噬水平降低，導(dǎo)致腎臟病理損傷進(jìn)行性加重[4]。在自噬眾多的調(diào)控因素中，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路占有樞紐地位。mTOR激活通過調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)、核糖體S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase1,S6K1)和其他蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制自噬體的形成，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[5]。微小RNA(microRNA，miR)是一類非編碼單鏈小RNA分子。大量研究證實(shí)miR在腎臟纖維化和DN發(fā)病機(jī)制中均發(fā)揮重要作用。通過檢索生物學(xué)信息預(yù)測網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-200b、miR-200c在DM中與mTOR有潛在結(jié)合位點(diǎn)。其中miR-101被報(bào)道在多種腫瘤細(xì)胞自噬過程中起著調(diào)控作用[6]。然而，miR-101能否通過調(diào)控mTOR信號通路誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在探討miR-101靶向mTOR信號通路在DN足細(xì)胞自噬中的作用，為DN的防治提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

雷帕霉素、鏈脲佐菌素和戊二醛(美國Sigma公司)；C57BL/6小鼠(南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所)；過碘酸-雪夫氏(Periodate-Shev’s，PAS)染液、蘇木精染液和檸檬酸鉛染液 (上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列：miR-101上游引物5′-GTACAGTACTGTGATA ACTGA-3′，下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；Nephrin上游引物5′-GCCTCCCTTCTTCTAAGCAGTCTA-3′，下游引物5′-TCAGTTCTCTCCACTTTGATGCC-3′；LC3Ⅰ上游引物5′-TCCGACCGGCCTTTCAAGCAG-3′，下游引物5′-GAGAACCTGACCAGAACTCCCAG-3′；LC3Ⅱ上游引物5′-AAACGCATTTGCCATCACAGT-3′，下游引物5′-GTGAGGACTTTGGGTGTGGTTC-3′；mTOR上游引物5′-ATTTGATCAGGTGTGCCAGT-3′，下游引物5′-GCTTAGGACATGGTTCATGG-3′；AMPK上游引物5′-GCTGTGGATCGCCAAATTAT-3′，下游引物5′-CACGTGCTCATCATCGAAAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；ASP300S型組織脫水機(jī)、EG1150型包埋機(jī)、Leica RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備(德國Leica公司)；奧林巴斯CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；TECNAI-10 透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；NanoDrop 2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BD公司)。

1.2 分組及造模

選30只成年雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠平均分為對照組、模型組和雷帕霉素組，每組10只。在禁食不禁水12 h 后，模型組和雷帕霉素組小鼠連續(xù)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(55 mg·kg-1)5 d，對照組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射STZ后1 周，采用尾靜脈針刺取血的方法檢測小鼠空腹血糖，血糖>13.8 mmol·L-1即確定DM 模型構(gòu)建成功。造模成功后，雷帕霉素組小鼠腹腔注射雷帕霉素(2 mg·kg-1)，對照組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，隔天1次，連續(xù)12周后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 腎臟組織PAS染色

脊髓脫臼處死小鼠，切取雙側(cè)腎臟，剝離腎臟包膜及腎周脂肪。左側(cè)腎臟經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，切片(3 μm)，二甲苯脫蠟(20 min)，蒸餾水沖洗。1.5%高碘酸處理25 min，蒸餾水反復(fù)洗滌，PAS染色30 min。流水沖洗10 min，直至顯出紅色。蘇木素復(fù)染5 min，流水沖洗。脫水，透明，封片。在光鏡下觀察染色結(jié)果并照相。PAS染色結(jié)果判定：腎小球基膜、系膜基質(zhì)、纖維蛋白等呈紫紅色即為PAS陽性，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。光鏡觀察腎小球病理變化。

1.4 透射電鏡觀察足細(xì)胞損傷及自噬情況

快速剪取少量右腎皮質(zhì)置于預(yù)冷的2.5%戊二醛中，剩余部分置于液氮中保存。用刀片在固定液中將組織切成約1 mm3大小。在冰上用鋒利的刀片快速準(zhǔn)確切取腎皮質(zhì)，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，1%鋨酸固定樣品1 h，再用磷酸鹽緩沖液漂洗3次。用不同濃度的丙酮逐級脫水，最后無水丙酮滲透后環(huán)氧樹脂包埋，切片(60 nm)，用檸檬酸鉛染色10 min，用蒸餾水漂洗3次，然后醋酸鈾染色30 min，再用蒸餾水漂洗3次，待切片干燥后在透射電鏡下觀察。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)檢測腎組織中miR-101、Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、mTOR和AMPK mRNA的表達(dá)

將右腎研碎，采用Trizol法提取總RNA，并進(jìn)行RNA濃度和純度的測定，將提取的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μl反應(yīng)體系，在CFX-96 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性 95 ℃ 5 s、60 ℃ 44 s，40個(gè)循環(huán)，61 ℃采集熒光，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-101、Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、mTOR和AMPK mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)

對照組小鼠腎臟基本正常，模型組小鼠腎臟局部可見球囊融合，系膜基質(zhì)明顯增多，雷帕霉素組小鼠腎臟系膜基質(zhì)明顯減少，見圖1。與對照組相比，模型組和雷帕霉素組小鼠系膜基質(zhì)面積明顯增多[(22.18±4.25)、(16.02±3.10) μm2vs(7.92±1.13) μm2，t=10.254、7.763，P<0.001]；與模型組比較，雷帕霉素組小鼠系膜基質(zhì)面積明顯減少[(16.02±3.10) μm2vs(22.18±4.25) μm2，t=3.703，P=0.002]。

圖1 各組小鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果 ×400

2.2 各組小鼠腎臟足細(xì)胞自噬情況

對照組小鼠腎臟足細(xì)胞足突正常；而模型組小鼠腎臟基底膜明顯增厚，足突明顯增寬、融合，自噬體明顯減少；雷帕霉素組小鼠腎臟基底膜增厚和足突融合明顯減輕，自噬體明顯增加。見圖2、3。

圖2 各組小鼠腎臟足細(xì)胞足突、基底膜情況 ×1 000

2.3 各組小鼠腎組織中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101、mTOR和AMPK mRNA水平比較

與對照組相比，模型組和雷帕霉素組小鼠腎組織中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101和AMPK mRNA水平明顯降低，mTOR mRNA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，雷帕霉素組小鼠腎組織中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101和AMPK mRNA水平明顯升高，mTOR mRNA水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

3 討 論

DM會導(dǎo)致腎臟足細(xì)胞不可逆的損傷和功能障礙，從而導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少，加速DN的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腎臟組織中的足細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面與對照組小鼠存在顯著差異。Nephrin是足細(xì)胞特異性標(biāo)記分子，具有離子通道和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在足細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和足隔膜功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7]。DM患者發(fā)生足細(xì)胞損傷，Nephrin的表達(dá)水平發(fā)生改變[8]。RT-PCR分析顯示，模型組小鼠Nephrin mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組，證實(shí)DM引起腎細(xì)胞損傷，PAS染色結(jié)果也支持這一結(jié)論。

自噬是一種細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，發(fā)生在老化或受損的細(xì)胞，以清除受損的細(xì)胞器和大分子。DN個(gè)體自噬水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞器和大分子在細(xì)胞內(nèi)積累，無法被清除，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[9]。雷帕霉素是 mTOR信號通路特異性的抑制劑，其對足細(xì)胞的保護(hù)作用可能與抑制mTOR有關(guān)。在DN的研究中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素與mTOR激酶結(jié)合，抑制mTOR活性，調(diào)節(jié)自噬，減輕腎臟損傷和功能失調(diào)[10]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組自噬降低，雷帕霉素組自噬升高。自噬受多種信號通路的調(diào)控，mTOR在自噬信號通路中占有舉足輕重的地位[11]。mTOR的激活可以抑制自噬小體的形成，其上游調(diào)節(jié)因子包括生長因子、胰島素水平、營養(yǎng)、代謝條件和機(jī)械變化。這些因素的變化在DM患者中廣泛存在，并已在許多研究中得到證實(shí)[12]。激活的mTOR通過磷酸化S6K1調(diào)控DM個(gè)體足細(xì)胞的Nephrin mRNA翻譯和轉(zhuǎn)錄等重要生理功能，從而減少自噬[13]。LC3Ⅰ和LC3-Ⅱ是哺乳動(dòng)物自噬體膜蛋白的標(biāo)志物，可以反映自噬的變化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腎組織中mTOR水平明顯增多，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平降低，而給予雷帕霉素干預(yù)后結(jié)果相反，證實(shí)了mTOR信號通路在DN腎損傷中的重要作用。DN的發(fā)生可能與自噬誘導(dǎo)足細(xì)胞的損傷和破壞有關(guān)，這種自噬的改變與足細(xì)胞中mTOR的活性有關(guān)。因此，通過抑制足細(xì)胞mTOR激活來維持自噬可能是DN的重要治療靶點(diǎn)。

為了尋找mTOR表達(dá)下調(diào)的可能機(jī)制，作者通過DIANA-MICROT和MICRORNA.ORG等生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)，miR-101與mTOR mRNA的3′-UTR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，miR-101過表達(dá)可以顯著促進(jìn)直腸癌細(xì)胞自噬[15]。此外，在雷帕霉素干預(yù)的情況下，DN小鼠腎組織中miR-101過表達(dá)，抑制mTOR信號通路的激活，提示miR-101可能參與了DN的發(fā)病和進(jìn)展。為了進(jìn)一步研究miR-101參與DN發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制，我們研究了miR-101對AMPK/mTOR信號通路的影響。mTOR已被確定為AMPK的一個(gè)間接靶點(diǎn)，并受到AMPK的負(fù)調(diào)控，這一過程對細(xì)胞的生長和存活至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，MAPK誘導(dǎo)的mTOR抑制發(fā)生在神經(jīng)毒素三丁基錫誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡過程中的自噬[16]。過氧化氫通過激活A(yù)MPK抑制mTOR信號通路并導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[17]。在本研究中，miR-101過表達(dá)下調(diào)了mTOR mRNA表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了AMPK mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示miR-101過表達(dá)可能通過抑制mTOR信號通路阻止DN的進(jìn)展。

綜上所述，自噬在DN發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，miR-101通過靶向抑制mTOR水平促進(jìn)DN小鼠足細(xì)胞自噬，同時(shí)促進(jìn)MAPK的表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，可能是DN患者治療的新靶點(diǎn)。