脂肪干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制的研究進(jìn)展

郭廷賢，陸無畏，郭芳芳

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 燒傷整形科，江蘇 南京 210009)

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，是從脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞。已證實(shí)ADSCs可分化成多種細(xì)胞譜系，具備修復(fù)、維護(hù)或增強(qiáng)各種組織的潛力[1-2]。ADSCs來源豐富，分離、鑒定與培養(yǎng)較易操作，不存在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞時(shí)的倫理道德問題[3]。與其他干細(xì)胞比較，ADSCs在實(shí)際應(yīng)用方面有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)來源。創(chuàng)面修復(fù)狀況會(huì)影響患者生活質(zhì)量，一直是外科學(xué)中的熱點(diǎn)問題。VECs能促進(jìn)受損組織血運(yùn)重建及受損器官功能恢復(fù)[4]，但其來源是臨床應(yīng)用的瓶頸。研究證實(shí)ADSCs在特定條件下可分化為VECs，將獲得的細(xì)胞注入受損組織可加快創(chuàng)面修復(fù)[5]。

1 ADSCs與VECs的鑒定

1.1 ADSCs的鑒定

ADSCs與其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣均表達(dá)多向分化潛能細(xì)胞的標(biāo)記分子，其功能的發(fā)揮在很大程度上依賴于表面表達(dá)的分子，同時(shí)這種表面標(biāo)記分子也是鑒定細(xì)胞種類的重要標(biāo)志。2013年，國(guó)際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(huì)[6]宣布從人體中分離的ADSCs表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而經(jīng)體外培養(yǎng)的ADSCs表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+。

1.2 VECs的鑒定

VECs作為形成血管壁的細(xì)胞，通過參與血管新生、分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)等血管舒張因子調(diào)節(jié)血管通透性，與血管中的成分相互作用在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮極為重要的作用[7]。對(duì)于VECs的鑒定，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大都會(huì)從以下3方面[8-10]進(jìn)行：(1) 形態(tài)學(xué)：鏡下成熟VECs具有特征性的鑲嵌狀鋪路石樣形態(tài)。(2) 細(xì)胞表面標(biāo)記：成熟VECs其表型為CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGF-R2)、VECs鈣黏連蛋白(VE-Cadherin)表達(dá)陽性，同時(shí)胞漿內(nèi)血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)染色陽性。(3) 細(xì)胞功能：成熟VECs應(yīng)具備小管形成的能力，分泌NO，并攝取乙?；兔芏戎鞍?acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)。

2 ADSCs分化為VECs的誘導(dǎo)方法

誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化的方法雖然很多，但主要是培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)、共培養(yǎng)以及基因轉(zhuǎn)染3種方法。

2.1 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)

培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)多采用直接誘導(dǎo)分化。Colazzo等[9]將培養(yǎng)至第3代ADSCs的培養(yǎng)基中添加50 ng·ml-1的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來誘導(dǎo)分化，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，有15%的細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)記物呈陽性，這些細(xì)胞也能夠攝取ac-LDL，并在Matrigel成管實(shí)驗(yàn)中形成管狀結(jié)構(gòu)。劉琳等[10]在Colazzo等的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加入了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)過21 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)被誘導(dǎo)的ADSCs的細(xì)胞形態(tài)向VECs轉(zhuǎn)化，呈鋪路石樣形態(tài),VECs第Ⅷ因子相關(guān)抗原染色細(xì)胞陽性,透射電鏡下可見W-P小體(Weibel-Palade body)。以上都表明在誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化時(shí)，培養(yǎng)基添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有積極的作用。Shang等[11]在誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化時(shí)，設(shè)計(jì)了在培養(yǎng)基添加VEGF和骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)，并聯(lián)合缺氧環(huán)境處理的誘導(dǎo)方法。結(jié)果表明，在添加VEGF的條件下，ADSCs就可以向VECs分化，但是分化率不高，而聯(lián)用BMP-4的細(xì)胞組分化程度較高，分化的細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。值得注意的是，缺氧處理?xiàng)l件下的ADSCs不僅高度表達(dá)了VECs標(biāo)記物，包括 CD31、VEGF-R2 和 VE-Cadherin，還顯示出體外血管生成的潛力，可以攝取ac-LDL并具備體外分泌NO的能力。

研究均顯示，在體外對(duì)ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)時(shí)VEGF是至關(guān)重要的，其作用促使ADSCs向VECs分化。但值得注意的是，當(dāng)在培養(yǎng)基繼續(xù)添加血管發(fā)生相關(guān)的其他細(xì)胞因子時(shí)，ADSCs分化為VECs的程度往往會(huì)升高，與此同時(shí)獲得的VECs的數(shù)量也會(huì)增多[9-11]。

2.2 共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)

焦自釗等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將ADSCs和VECs以1∶1的比例在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，最終共培養(yǎng)上清液中VEGF、b-FGF濃度明顯高于VECs單獨(dú)培養(yǎng)組，同時(shí)ADSCs有明顯的向VECs分化趨勢(shì)，并具有VECs的形態(tài),研究提示ADSCs可能通過直接分泌或間接作用來促進(jìn)VECs分泌VEGF、b-FGF等細(xì)胞因子，進(jìn)而影響VECs增殖及血管化，也改變了ADSCs的分化方向。最新研究中，石志康等[13]將兔的ADSCs和VECs共培養(yǎng)接觸，結(jié)果可見體外培養(yǎng)擴(kuò)增的ADSCs呈梭形生長(zhǎng)，VECs形態(tài)多樣，呈鋪路石樣。經(jīng)免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)ADSCs與VEC共培養(yǎng)組上清夜中VEGF、平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)組,該研究提示我們ADSCs和VECs經(jīng)體外共培養(yǎng)可作為種子細(xì)胞參與組織工程用于增加組織血管的生成。

在這些共培養(yǎng)的研究中均發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)上清液可以檢測(cè)到VEGF的表達(dá)增加，ADSCs可以向VECs分化。

2.3 基因轉(zhuǎn)染定向誘導(dǎo)

關(guān)于使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來進(jìn)行定向誘導(dǎo)的方法，李江璇等[14]通過將攜帶 VEGF基因的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染于人ADSCs,檢測(cè)其培養(yǎng)基上清液中細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF基因后的人ADSCs可以分泌VEGF和b-FGF，培養(yǎng)基的上清液也可以提高VECs的增殖活力和遷移能力。同時(shí)還有研究者[15]將含有血小板衍生內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)基因的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染于兔ADSCs，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，注入皮下觀察ADSCs的形態(tài)和其表達(dá)蛋白，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了PDGF基因的ADSCs表達(dá)PDGF的數(shù)量明顯增加，同時(shí)皮下新生血管數(shù)量明顯增加，說明基因轉(zhuǎn)染的方法可促進(jìn)ADSCs分泌細(xì)胞因子，同時(shí)促進(jìn)ADSCs向VECs分化。

以上研究說明ADSCs具有向VECs分化的潛力，是VECs體外來源的理想途徑，誘導(dǎo)過程中VEGF尤為重要。只有對(duì)分化機(jī)制進(jìn)行深入研究和探索，才能獲得高分化度、高成熟度、高轉(zhuǎn)化率的血管內(nèi)皮種子細(xì)胞，進(jìn)而為組織工程血管構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)。

3 ADSCs分化為VECs的相關(guān)機(jī)制

對(duì)誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化機(jī)制的研究很多，近期研究主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞表面蛋白受體、通過細(xì)胞攜帶外泌體和影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路3個(gè)方面。

3.1 通過調(diào)節(jié)ADSCs表面酪氨酸激酶受體來影響分化方向

Mustonen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，成熟VECs表面有3類主要的酪氨酸激酶受體及其配體家族(VEGF/VEGFR、Ang/Tie、Ephrin/Eph)，其在血管的生成中起到了相當(dāng)重要的作用。Cheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Eph的受體酪氨酸激酶的活化,在VEGF依賴的血管生成中具有重要作用，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示:(1) VEGF能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮上酪氨酸激酶受體EphrinA的表達(dá)和內(nèi)源性EphA2受體活化磷酸化；(2)如果阻滯EphA受體的活性，會(huì)抑制VEGF依賴的血管形成。同時(shí)還有研究顯示,EphB的配體EphrinB2能抑制VEGF和血管生成素(angiopoietin-1，Ang-1)誘導(dǎo)的RAS/MAPK信號(hào)途徑,從而抑制VEGF和Ang-1誘導(dǎo)的動(dòng)脈處VECs增殖和遷移[18]，這對(duì)動(dòng)靜脈交界處毛細(xì)血管內(nèi)皮正確的形態(tài)學(xué)發(fā)生是極為重要的因素。Shang等[11]成功誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化，其潛在機(jī)制就是在低氧環(huán)境下EphrinB2的去甲基化，影響了后續(xù)相關(guān)的蛋白合成信號(hào)通路，促進(jìn)了ADSCs向VECs的分化，可以進(jìn)一步認(rèn)為，影響ADSCs表面受體酪氨酸激酶的活性，可以定向促進(jìn)ADSCs向VECs分化。

3.2 通過ADSCs外泌體攜帶物質(zhì)來影響分化方向

外泌體是細(xì)胞胞膜系統(tǒng)通過主動(dòng)分泌排出的一種直徑40～150 nm的盤狀小囊泡，同時(shí)外泌體具有和其來源細(xì)胞相同的生物學(xué)功能[19-20]。研究顯示，不同來源的外泌體其合成分泌的RNA具有不同的結(jié)構(gòu),產(chǎn)生特定的生物調(diào)控信息,從而影響機(jī)體生理過程[21-22]。張靜等[23]將收集到的ADSCs外泌體注入人臍靜脈VECs的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組；體外Matrigel成管實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組形成管狀結(jié)構(gòu)明顯增多，提示ADSCs外泌體可以促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖、遷移及管樣結(jié)構(gòu)形成。而張亞等[24]研究ADSCs分化成VECs前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)mi-RNA通過調(diào)控與干細(xì)胞的分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、跨膜蛋白、結(jié)合蛋白等息息相關(guān)的靶基因，從而參與調(diào)控人ADSCs向VECs的分化過程。

以上研究表明，ADSCs外泌體攜帶的不同mi-RNA，通過影響后續(xù)相關(guān)靶基因的表達(dá)，可以誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化，例如一項(xiàng)來自國(guó)外學(xué)者的研究就表明誘導(dǎo)前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達(dá)，可以介導(dǎo)靶基因EphrinB2調(diào)控VEGF依賴的血管生成，同時(shí)可調(diào)節(jié)纖溶酶和基質(zhì)金屬酶兩種蛋白的活性來調(diào)控ADSCs向VECs分化[25]。

3.3 通過影響ADSCs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響分化方向

許多研究表明，ADSCs具有多向分化的潛能，通過多種信號(hào)通路介導(dǎo)ADSCs可以分化為多種不同的細(xì)胞，主要包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞等[26-30]，同時(shí)具有向VECs分化的能力。Hellstrom等[31]研究顯示，VEGF信號(hào)通路的下游通路Dll4/Notch信號(hào)通路在調(diào)控新生血管形成上具有極其重要的意義，這也是VEGF在血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)。而Kim等[32]也發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)通路的下游通路Alk1-BMPRII / ActRII-ID1 / ID3通路在血管新生中起到了重要的調(diào)控作用，這也是Shang等[11]在誘導(dǎo)ADSCs向VECs分化時(shí)聯(lián)合使用VEGF和BMP-4的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。殷令妮等[33]研究發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)不僅可以刺激ADSCs增殖，還可以促進(jìn)ADSCs向VECs分化，此過程是由PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)發(fā)生，此通路還介導(dǎo)多種細(xì)胞因子如VEGF、PDGF的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)ADSCs向VECs分化。

4 ADSCs定向分化為VECs的應(yīng)用現(xiàn)狀

近些年來，隨著人們對(duì)于誘導(dǎo)ADSCs向VECs轉(zhuǎn)化的研究深入，ADSCs越來越多地被應(yīng)用在血管組織工程之中。Volz等[34]研究認(rèn)為，如何應(yīng)對(duì)重度燒傷創(chuàng)面修復(fù)、畸形矯正術(shù)后和腫瘤切除術(shù)后的受損軟組織的替代，成為臨床上一個(gè)棘手的問題。盡管目前外科手術(shù)技術(shù)的不斷革新和諸多新型合成材料的應(yīng)用在一定程度上緩解了這一情況，但在供體和受體部位的實(shí)際應(yīng)用中仍存在大量局限性和并發(fā)癥，影響預(yù)后質(zhì)量，因此迫切需要開發(fā)出新的方法以及材料允許永久替代自身軟組織[35]。ADSCs的誘導(dǎo)分化作為血管化脂肪組織工程的基本工具，應(yīng)用其開發(fā)安全、高效的體外脂肪組織構(gòu)建物成為了當(dāng)今的技術(shù)熱點(diǎn)，尤其是脂肪組織工程血管化，在血管組織工程中具有更重要的地位。Kayabolen 等[36]開發(fā)出了一個(gè)具有良好機(jī)械性能的生物相容性的水凝膠支架，將脫細(xì)胞脂肪組織(decellularized adipose tissue，DAT)和纖維蛋白(Fibroin，F(xiàn)ib)以1∶3的比例混合制備水凝膠，該水凝膠支架是具有良好的支持VECs生存的脂肪組織構(gòu)建物。Park等[37]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ADSCs引起的三維細(xì)胞團(tuán)(three dimensional cell masses，3DCMs)發(fā)生了缺氧狀況，加速了VEGF的表達(dá)，促進(jìn)了新生血管的生成，說明ADSCs的3DCMs可以用作新血管形成的VECs來源，也可以與其他細(xì)胞類型共同植入進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)研究。

目前來說，血管化脂肪組織工程是一個(gè)非常有前景的領(lǐng)域，期待著我們尋找到新的可誘導(dǎo)ADSCs分化為VECs的靶點(diǎn)，或者構(gòu)建新的模型來進(jìn)行血管組織工程。不過我們?nèi)詰?yīng)當(dāng)意識(shí)到，盡管ADSCs分化被視為再生醫(yī)學(xué)中新的干細(xì)胞療法的工具鑰匙，但仍需綜合宿主環(huán)境和患者相關(guān)因素，通過進(jìn)一步研究以提高其效率及可應(yīng)用性[38]。

5 展 望

ADSCs在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面存有巨大潛力，尤其是血管脂肪組織工程化更是具有非常大的發(fā)展前景。但如何尋找到一個(gè)新的靶點(diǎn)，以及怎樣通過最新技術(shù)構(gòu)建一個(gè)高效安全可利用的模型都是非常值得探索的。相信在不久的未來，隨著血管組織工程理論的不斷完善，我們可以結(jié)合最新的科學(xué)技術(shù)制作出應(yīng)用于受損組織的安全、高性能的再生血管替代材料。