外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-150表達(dá)對(duì)STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生左心室重構(gòu)的預(yù)測(cè)價(jià)值

高紅霞，楊彩霞，任剛

(鐵嶺市中心醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 鐵嶺 112000)

盡管經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)可迅速恢復(fù)心肌灌注，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)左室功能障礙，從而導(dǎo)致不利的心肌重塑[1]。左心室重構(gòu)(left ventricular remodeling，LVR)過(guò)程大大增加了嚴(yán)重心血管不良事件包括死亡的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此對(duì)LVR進(jìn)行早期危險(xiǎn)分層有助于對(duì)高?；颊哌M(jìn)行密切觀察和更積極的治療。微小RNA(miRNAs)的發(fā)現(xiàn)為識(shí)別生物標(biāo)志物和開(kāi)發(fā)新的治療工具提供了新的機(jī)會(huì)。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-150對(duì)于大鼠成纖維細(xì)胞增殖活性具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[3]，其在心肌梗死邊緣區(qū)表達(dá)下降，且可通過(guò)靶基因c-Myb改善心肌纖維化[4]；此外羅穆玲等[5]也證實(shí)老年慢性心衰患者血清miR-150表達(dá)與心室重構(gòu)有關(guān)。在本研究中，我們旨在探討ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者PCI術(shù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR-150表達(dá)與LVR發(fā)生的潛在關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2018年3月至2019年1月在我院接受急診PCI術(shù)的165例STEMI患者完成本隊(duì)列研究，患者以典型急性胸痛和持續(xù)性ST段抬高為特征[≥30 min，以V2～V3導(dǎo)聯(lián)ST段抬高(在J點(diǎn)處)≥0.2 mV(男性)或ST段抬高≥0.15 mV(女性)為基礎(chǔ)表現(xiàn)，完成心梗4項(xiàng)檢查]，發(fā)病24 h內(nèi)行急診PCI術(shù)。如果PCI術(shù)失敗(病變部位殘留狹窄>30%)、預(yù)計(jì)生存時(shí)間<12個(gè)月、合并肝硬化或其他嚴(yán)重心臟病變(心瓣膜病、心肌病或心包膜疾病)、有腎臟病史、已知的惡性腫瘤、炎癥或嚴(yán)重感染性疾病者，則被排除在本研究之外。在1年的隨訪期間，所有患者服用阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1，并在1年后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖評(píng)估。本研究方案得到了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者都簽署了書(shū)面的知情同意書(shū)。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢查

所有患者PCI術(shù)后7 d和隨訪1年后接受經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查(飛利浦iE33型超聲心動(dòng)圖儀)。靜脈注射0.5 ml造影劑SonoVue，保存心尖部四腔心切面和心尖部二腔心切面的視圖，通過(guò)雙平面法測(cè)量左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。術(shù)后1年復(fù)查超聲心動(dòng)圖時(shí)，若LVEDV比出院時(shí)增加≥20%則定義為L(zhǎng)VR[6]。超聲心動(dòng)圖的檢查由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的技師完成，并對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行離線處理。根據(jù)復(fù)查時(shí)是否發(fā)生LVR，將患者分為L(zhǎng)VR組和非LVR組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PBMCs中miR-150表達(dá)

所有患者PCI術(shù)后7 d采集外周血樣本，儲(chǔ)存在經(jīng)EDTA-2K處理過(guò)的試管里。采血時(shí)間點(diǎn)與第1次超聲心動(dòng)圖檢查時(shí)間一致。然后，采用試劑盒(美國(guó)cedarlane公司)用淋巴溶解液分離PBMCs。在提取RNA之前，PBMCs在無(wú)菌PBS中洗滌2次。用Trizol從PBMCs樣本中提取總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)光密度(optical density，OD)260/OD280和OD260/OD230，測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量。應(yīng)用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia公司)對(duì)總miRNAs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化為cDNA。將cDNA樣本保存在-20 ℃冰箱中。采用SYBR Green miRNA分析試劑盒(AceQTMqPCR Kit，中國(guó)Vazyme Biotech公司)配制20 μl PCR反應(yīng)體系，包含1.0 μl cDNA模板和各0.5 μl上下游引物。miR-150引物：正向5′-CTGTGTCCTGCCAGTGGTTTT-3′，反向5′-CGGTATCCTGTCCGTGGTTCT-3′；內(nèi)源性對(duì)照小分子U6 mRNA引物：正向5′-CGCGTTCGGCCACATAC-3′，反向5′-CAGGCCATGCTCTAATCTT-3′。PCR參數(shù)：95 ℃單循環(huán)5 min，95 ℃ 10 s和65 ℃ 40 s循環(huán)40次。PCR在ABI ViiA7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)上完成。用2-ΔΔCt法測(cè)定miR-150表達(dá)量，并以小分子U6 mRNA作為內(nèi)控。

1.4 其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

PCI術(shù)后7 d檢測(cè)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，取血樣置于真空管中，立即轉(zhuǎn)移到中心實(shí)驗(yàn)室，分別檢測(cè)血漿N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB type，CK-MB)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)。用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Roche Elecsys E170電化學(xué)發(fā)光儀)檢測(cè)血漿NT-proBNP水平，采用雙抗體夾心法(Roche Elecsys 2010 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀)檢測(cè)血漿cTnT、CK-MB水平，用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(Roche Cobas 8000自動(dòng)化學(xué)分析儀)檢測(cè)血漿CRP水平。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

用含有10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人HEK293T細(xì)胞，用于熒光素酶活性測(cè)定。用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)和10 ng報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，報(bào)告質(zhì)粒包含熒光素酶報(bào)告基因下游插入CRP的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)和30 nmol·L-1miR-150模擬物或陰性對(duì)照作為miR-150 mimics組和miR-NC組。分別與CRP 3′UTR野生型序列或突變型序列轉(zhuǎn)染24 h后用雙發(fā)光試劑盒(美國(guó)Genecopoeia公司)測(cè)定熒光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

隨訪1年，35例患者發(fā)生LVR，LVR發(fā)生率為21.21%。所有患者PCI術(shù)后都達(dá)到TIMI3級(jí)血流。LVR組和非LVR組STEMI患者的年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、既往疾病史、罪犯血管類(lèi)型、冠脈病變支數(shù)、支架選擇及PCI術(shù)后用藥情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表1)。

表1 兩組STEMI患者一般資料的比較

2.2 兩組術(shù)后7 d各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的差異

與非LVR組相比，LVR組患者血漿NT-proBNP、cTnI、CK-MB、CRP水平升高，同時(shí)PBMCs中miR-150相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表2)。

表2 兩組STEMI患者PCI術(shù)后7 d PBMCs中miR-150表達(dá)量及血漿NT-proBNP、cTnT、CK-MB、CRP水平的比較

2.3 影響STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生LVR的危險(xiǎn)因素

經(jīng)多因素Logistic回歸分析，STEMI患者PCI術(shù)后7 d時(shí)PBMCs中miR-150表達(dá)量、血漿CK-MB水平以及LVEF都是STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生LVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P<0.05，表3)。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生LVR的臨床因素

2.4 PCI術(shù)后7 d時(shí)PBMCs中miR-150表達(dá)量、血漿CK-MB水平以及LVEF對(duì)LVR發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析顯示，PCI術(shù)后7 d PBMCs中miR-150表達(dá)量和聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)LVR的曲線下面積(area under curve，AUC)大于單獨(dú)使用LVEF的AUC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.327、3.458，均P<0.05)(表4)。

表4 ROC曲線分析PCI術(shù)后7 d時(shí)PBMCs中miR-150表達(dá)量、血漿CK-MB水平以及LVEF對(duì)LVR的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-150和CRP的關(guān)系

生物信息學(xué)分析顯示，miR-150和CRP之間存在互補(bǔ)堿基對(duì)。熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，miR-150模擬物抑制了CRP-3′UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05，圖1)。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因法測(cè)定CRP mRNA和miR-150的靶向調(diào)控關(guān)系

3 討 論

對(duì)于STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生LVR，是導(dǎo)致死亡的重要危險(xiǎn)因素之一[7]。因此，在分子水平上尋求對(duì)生物學(xué)途徑的更深入了解，以及尋找可能預(yù)測(cè)LVR的潛在指標(biāo)具有重要的臨床價(jià)值。在本研究中，我們測(cè)定了STEMI患者PCI術(shù)后7 d時(shí)PBMCs中miR-150以及血漿cTnI、CK-MB、NT-proBNP的濃度，并評(píng)價(jià)LVEF，以確定這些生物標(biāo)志物是否能在1年內(nèi)預(yù)測(cè)LVR的發(fā)生。與未發(fā)生LVR的患者相比，LVR組患者PCI術(shù)后7 d時(shí)血漿NT-proBNP、cTnI、CK-MB水平升高，同時(shí)PBMCs中miR-150相對(duì)表達(dá)量降低；此外LVEF降低也是影響LVR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。雖然既往有報(bào)道指出，急性期cTnI和NT-proBNP濃度可以預(yù)測(cè)LVR，但是STEMI患者PCI術(shù)后影響這兩項(xiàng)指標(biāo)的客觀因素太多，因此他們對(duì)于LVR的預(yù)測(cè)能力較差。我們發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后7 d時(shí)PBMCs中miR-150表達(dá)、血漿CK-MB水平以及LVEF可以預(yù)測(cè)PCI術(shù)后1內(nèi)發(fā)生LVR的風(fēng)險(xiǎn)。

心肌梗死后LVR的機(jī)制是多因素的。心肌細(xì)胞壞死觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)擴(kuò)張、肥大和膠原瘢痕的形成過(guò)程[8]。在心肌梗死早期，心室擴(kuò)張和室壁變薄主要是由梗死區(qū)擴(kuò)張引起的。隨著時(shí)間的推移，血管壁張力增加，微循環(huán)功能障礙和炎癥介質(zhì)進(jìn)一步推動(dòng)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和擬交感神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和代償性左心室擴(kuò)張[9]。以往的研究表明，心肌損傷程度與LVR相關(guān)[10]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)LVR組和非LVR組患者在PCI術(shù)后7 d時(shí)血漿NT-proBNP、CK-MB水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且血漿CK-MB水平和LVEF是1年內(nèi)發(fā)生LVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。其可能的解釋為，在心肌梗死后早期，大面積梗死區(qū)擴(kuò)大后，可能通過(guò)非梗死性心肌肥大和球形左室重塑進(jìn)行更大程度的后期重塑，作為全面心肌功能減退的代償機(jī)制(Frank-Starling效應(yīng))[11]。

miRNAs是以細(xì)胞和組織特異性方式表達(dá)的短寡核苷酸，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和器官(包括心肌)功能的作用。由于在人類(lèi)外周血液中發(fā)現(xiàn)了它們的存在，并具有穩(wěn)定性，miRNAs已經(jīng)顯示出作為心血管疾病循環(huán)生物標(biāo)志物的潛力[12]。一些研究已經(jīng)報(bào)道了miRNAs表達(dá)失調(diào)在心臟衰竭或心肌肥厚中的功能性作用。Ma等[13]報(bào)道急性心肌梗死患者入院時(shí)血液循環(huán)miR-1是6個(gè)月內(nèi)發(fā)生心室重塑的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，而且與之前的臨床測(cè)量結(jié)果相比顯示出更高的預(yù)測(cè)效能。在本研究中，我們則發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后7 d PBMCs中miR-150表達(dá)水平降低可以預(yù)測(cè)STEMI患者PCI術(shù)后1年內(nèi)LVR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。雖然miR-150的預(yù)后價(jià)值已經(jīng)在膿毒癥[14]、急性白血病[15]患者中被報(bào)道過(guò)，但是與心肌梗死后LVR的關(guān)系尚未見(jiàn)明確的臨床報(bào)道。在一些基礎(chǔ)研究和其他疾病研究中，miR-150被證實(shí)是與炎癥有關(guān)的調(diào)節(jié)基因，而且主要表達(dá)于單個(gè)核細(xì)胞中。由于炎癥是心肌梗死后LVR發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，未來(lái)的研究需要確定 miR-150在這種重塑中的作用。Luo等[16]通過(guò)對(duì)ApoE-/-小鼠模型注射miR-150 mimics，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)干擾PTX3、NF-κB1和RELA表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，抑制血管重構(gòu)。Devaux等[3]通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎構(gòu)建心肌梗死小鼠模型，誘導(dǎo)心肌梗死15 d后，小鼠左心室擴(kuò)張，心肌梗死區(qū)可見(jiàn)明顯的膠原沉積；并且與假手術(shù)小鼠心肌組織及心肌遠(yuǎn)緣區(qū)和邊緣區(qū)相比，心肌梗死區(qū)miR-150的表達(dá)降低。我們的研究結(jié)果與之一致。在本研究中，我們通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)miR-150可以調(diào)節(jié)相關(guān)下游基因，其中miR-150和CRP之間存在互補(bǔ)堿基對(duì)。而且經(jīng)過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-150 mimics可以抑制CRP-3′UTR-WT的熒光素酶活性。然而由于CRP屬于急性期炎癥相關(guān)蛋白，有研究顯示，在PCI術(shù)后48 h內(nèi)測(cè)定CRP對(duì)臨床結(jié)果有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值，雖然CRP升高可持續(xù)1周，卻易受到多種合并癥、手術(shù)操作、心理應(yīng)激等外源性因素的干擾，因此在本研究中，雖然LVR組患者血漿CRP水平高于非LVR組患者，但是多因素Logistic回歸分析中，CRP并不是LVR發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。miR-150主要由循環(huán)單個(gè)核細(xì)胞分泌，轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞，并以旁分泌的方式調(diào)節(jié)其遷移[17]。本研究結(jié)果進(jìn)一步支持了PBMCs中miR-150的相對(duì)表達(dá)量降低與左心室不利重塑有關(guān)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后7 d PBMCs中miR-150表達(dá)、血漿CK-MB水平和LVEF是1年內(nèi)發(fā)生LVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。尤其是PBMCs中miR-150表達(dá)降低對(duì)1年內(nèi)LVR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值較高，這可能與其誘導(dǎo)CRP表達(dá)上調(diào)有關(guān)。因此，PBMCs中miR-150有望成為預(yù)測(cè)LVR發(fā)生的新的生物標(biāo)志物。