外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-143表達(dá)對(duì)STEMI患者急診PCI術(shù)后1年發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測價(jià)值

趙玉君，孫宏超，王翠平，董自平，路桂杰

(1.任丘市人民醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 任丘 062552；2.華北石油總醫(yī)院 急診科，河北 任丘 062552)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)是冠心病患者一個(gè)里程碑式的治療方法，然而部分患者在PCI術(shù)后1年內(nèi)會(huì)發(fā)生支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)，尤其是裸金屬支架ISR發(fā)生率較高，雖然使用藥物洗脫支架可將ISR的發(fā)生率降低到5%～10%，但是仍不可避免[1]。球囊和支架可引起血管損傷進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖，此外包被劑的非細(xì)胞特異性特征也損害內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致血栓形成或動(dòng)脈粥樣硬化，造成晚期治療失敗[2]。最近的研究表明，一些微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以作為預(yù)測或診斷疾病及不良事件的生物標(biāo)志物[3]。miR-143是miRNAs家族的成員，位于5號(hào)染色體上，在血管平滑肌中大量存在[4]。已有研究證明，miR-143水平與誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞抗動(dòng)脈粥樣硬化表型有關(guān)[5]。孟霖霖[6]發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-143/145水平與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，可反映冠脈狹窄程度。然而關(guān)于miR-143是否參與動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞缺損尚缺乏直接的證據(jù)支持?；谏鲜鲂畔?，本研究旨在通過前瞻性研究，探討外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR-143表達(dá)對(duì)ST 段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者急診PCI術(shù)后1年發(fā)生ISR的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取72例2019年3月至10月在任丘市人民醫(yī)院接受急診PCI術(shù)的STEMI患者作為研究對(duì)象，并定期隨訪至少1年，進(jìn)行前瞻性巢式病例對(duì)照研究。以入院首次進(jìn)行急診PCI作為研究起點(diǎn)，以隨訪期間發(fā)生ISR作為研究終點(diǎn)；采用巢氏病例對(duì)照研究法，將ISR患者定義ISR組。每當(dāng)發(fā)生1例ISR，立即同時(shí)以患者年齡、性別、體重指數(shù)等基線信息作為匹配條件，按照1∶1從同隊(duì)列中選擇匹配的患者作為對(duì)照組。最終ISR組33例患者，非ISR組39例患者。經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)ISR的診斷。冠狀動(dòng)脈再狹窄定義為支架段再狹窄超過血管直徑的50%[7]。在PCI術(shù)后3 h內(nèi)采集血液樣本，研究對(duì)象具有詳細(xì)和可追溯的醫(yī)療記錄，包括血生化、心電圖、冠狀動(dòng)脈造影、心胸外科手術(shù)報(bào)告等，STEMI在患者的醫(yī)療診斷記錄中得到確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：再狹窄診斷前再次植入支架者，患有嚴(yán)重的肝腎功能不全、感染、腫瘤、心力衰竭、透析、結(jié)締組織疾病等患者。應(yīng)用血管內(nèi)超聲(intravascular ultrasound，IVUS)觀察病理血管的變化。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 提取PBMCs并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測PBMCs中miR-143含量

清晨空腹取5 ml外周靜脈血，用抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)處理。用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離，-80 ℃保存。37 ℃下快速復(fù)活，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次。離心后吸去細(xì)胞上清，制備PBMCs供進(jìn)一步使用。用Trizol(美國Invitrogen公司)從PBMCs中提取總RNA，使用紫外Nandodrop2000?分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)測定總RNA的濃度和純度，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并在-80 ℃低溫保存。每個(gè)樣品都重復(fù)分析3次。采用Taqman advanced mirna assay 和Taqman fast advanced master mix試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。循環(huán)條件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-143的相對(duì)表達(dá)量。miR-143正向引物5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′，反向引物5′-GCCTGAGATGAAGCACTGT-3′；U6正向引物5′-GACGAATACCGGCGTGAGAA-3′，反向引物5′-AAATTCTGTTTGCGGTGCGT-3′。

1.3 其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測

每個(gè)受試者在我院檢驗(yàn)科用分離膠促凝管取全血3 ml，使用離心機(jī)在2～8 ℃、2 000 r·min-1條件下處理30 min，分離血清，保存在-20 ℃或-80 ℃條件下，避免反復(fù)凍融處理。用ELISA試劑盒(上海通蔚生物公司)測定血清B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的水平。以水平軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，垂直軸為光吸收值，用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測指標(biāo)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，試驗(yàn)前所有試劑混合均勻。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組STEMI患者一般資料的比較

兩組患者的年齡、性別構(gòu)成、高危因素(高脂血癥史、高血壓史、吸煙史和飲酒史)、體重指數(shù)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、隨訪期間用藥史等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ISR組患者糖尿病史比例、血糖、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)高于非ISR組，支架長度長于非ISR組，支架直徑小于非ISR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料的比較

2.2 PBMCs中miR-143水平與ISR發(fā)生的相關(guān)性

與非ISR組(1.00±0.14)相比，ISR組患者PBMCs中miR-143相對(duì)表達(dá)量(0.62±0.21)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單因素和多因素 Logitic回歸分析顯示，排除5個(gè)臨床因素(糖尿病史患者比例、血糖、LDL-C、支架長度、支架直徑)干擾后，miR-143與ISR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(OR=6.367，95%CI2.434～13.679，P<0.05)。

2.3 PBMCs中miR-143表達(dá)對(duì)STEMI患者急診PCI術(shù)后1年發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的預(yù)測價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)后PBMCs中miR-143表達(dá)預(yù)測STEMI患者急診PCI術(shù)后1年發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的AUC為0.954(95%CI0.910～0.998)，cut-off值為0.795，在該閾值下靈敏度和特異度分別為94.9%和81.8%。見圖1。

圖1 PBMCs中miR-143表達(dá)預(yù)測STEMI患者急診PCI術(shù)后1年發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的ROC曲線

2.4 兩組患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平的比較

ISR組患者血清Bcl-2和IL-6水平高于非ISR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者血清IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平比較 pg·ml-1

2.5 PBMCs中miR-143表達(dá)與血清Bcl-2、IL-6水平的相關(guān)性

ISR組患者PBMCs中miR-143相對(duì)表達(dá)量與血清Bcl-2、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.739、-0.646，P<0.05)，血清Bcl-2水平與IL-6水平呈正相關(guān)性(r=0.801，P<0.05)。見圖2。

圖2 ISR組患者PBMCs中miR-143表達(dá)與血清Bcl-2、IL-6水平的關(guān)系

3 討 論

目前急診PCI術(shù)是臨床治療 STEMI 的最有效方法，STEMI 患者在接受 PCI 手術(shù)后冠狀動(dòng)脈的血流恢復(fù)，預(yù)后改善，但是ISR依然是PCI治療技術(shù)的致命弱點(diǎn)[8]。近年來，盡管我們已經(jīng)對(duì)ISR進(jìn)行了臨床和基礎(chǔ)研究，并在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、預(yù)防和治療方面取得了重大進(jìn)展，然而強(qiáng)化的抗血小板和他汀類藥物治療以及嚴(yán)格的術(shù)后處理似乎不能有效預(yù)防部分患者ISR的發(fā)生。因此越來越多的學(xué)者開始考慮基因方面的原因[9]。miRNAs是一類進(jìn)化上高度保守、內(nèi)源性單鏈、非編碼的小分子RNA，因其在循環(huán)血液中的穩(wěn)定性以及相對(duì)的細(xì)胞和(或)組織特異性，為檢測遺傳背景差異提供了一種簡便的方法。miR-143位于人類5號(hào)染色體上，在造血、免疫、炎癥、癌癥和心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Zhou等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143與膿毒癥患者免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。PBMCs是從外周血中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞，由 T、B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞組成，在免疫應(yīng)答中起著重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ISR組患者PBMCs中miR-143相對(duì)表達(dá)量低于非ISR組，miR-143表達(dá)降低的STEMI患者PCI術(shù)后存在較高的ISR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與其他因素?zé)o關(guān)。

ISR的基本機(jī)制是血小板、白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，導(dǎo)致中膜平滑肌細(xì)胞遷移和增殖。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)約1/3的ISR事件是由于支架內(nèi)新生動(dòng)脈粥樣硬化，這明顯不同于傳統(tǒng)的機(jī)制[11]。然而，在這些機(jī)制中確實(shí)存在一個(gè)共同的現(xiàn)象，即ISR和支架內(nèi)新生動(dòng)脈粥樣硬化。以往的研究證實(shí)，miR-143在血管平滑肌細(xì)胞中呈高度特異性表達(dá)，并且在VSMCs的增殖和遷移過程以及動(dòng)脈功能中發(fā)揮重要作用[12]。而且在冠狀動(dòng)脈受損或動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型中，如ApoE基因敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化、小鼠結(jié)扎誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈和大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷中，miR-143表達(dá)同樣顯著下降[13]。miR-143是位于人類5號(hào)染色體上的多功能 miRNA。Zhang等[14]證實(shí) miR-143通過促進(jìn)記憶T細(xì)胞分化和代謝重編程，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤作用；Vatandoost等[15]證實(shí)PBMCs與全身器官保持密切的聯(lián)系，因此可能表現(xiàn)出與胰島素靶器官有關(guān)的 miR-143改變，與正常健康對(duì)照組相比，糖尿病前期和明顯糖尿病期患者PBMCs中miR-143表達(dá)顯著降低。上述研究均證實(shí)miR-143與炎癥及免疫密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和免疫因子的釋放。本研究中我們也證實(shí)ISR患者血清PBMCs中miR-143相對(duì)表達(dá)量較非ISR組患者降低，并且miR-143低表達(dá)是STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生ISR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果提示 miR-143參與了動(dòng)脈粥樣硬化的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制。

成熟的 miRNA是由一系列核酸酶切斷長初始轉(zhuǎn)錄物而產(chǎn)生的。miR-143是 miRNA分子的一種，而Bcl-2是miR-143的直接靶向因子。陳玉婷等[16]研究證實(shí)，冠心病患者PCI術(shù)后血清Bcl-2水平明顯升高，且血清Bcl-2高表達(dá)可能是ISR的一個(gè)重要原因，藥物綜合治療可使冠心病患者血清Bcl-2表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而有效地預(yù)防ISR的發(fā)生。ISR的發(fā)生與血管平滑肌細(xì)胞過度增殖和炎癥刺激有關(guān)。Elia等[17]體外和動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，miR-143表達(dá)缺失可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞分化不完全，進(jìn)而引起主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)改變，說明miR-143在平滑肌細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，并強(qiáng)烈提示它參與了平滑肌細(xì)胞分化表型的逆轉(zhuǎn)，這種逆轉(zhuǎn)發(fā)生于平滑肌細(xì)胞分化過程中的多種血管疾病，包括ISR[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PBMCs中miR-143低表達(dá)與血清Bcl-2和IL-6高表達(dá)有關(guān)，說明miR-143低表達(dá)可能是引起血管平滑肌細(xì)胞凋亡及血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。

綜上所述，STEMI患者PBMCs中miR-143低表達(dá)是PCI術(shù)后1年發(fā)生ISR風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其表達(dá)水平降低與血清Bcl-2和IL-6水平升高有關(guān)，因此上調(diào)PBMCs中 miR-143表達(dá)有望成為一個(gè)有效預(yù)防ISR的靶點(diǎn)。但是本研究存在一定的局限性，例如我們無法確定藥物治療對(duì)miR-143水平的影響，從而導(dǎo)致本結(jié)果可能存在一定偏差。進(jìn)一步的研究應(yīng)該旨在揭示某些藥物治療與PBMCs中miR-143水平變化及相關(guān)預(yù)后的關(guān)系。