LncRNA DLG1-AS1調(diào)控miR-203/ZEB2軸誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞惡性化生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

馮立新，翟傳夫，譚清玉

(臨沂市中醫(yī)醫(yī)院 普外三科，山東 臨沂 276000)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)最為常見(jiàn)[1]。雖然相較于髓樣癌和未分化癌，大部分PTC生長(zhǎng)緩慢、侵襲性弱、分化良好，但是仍有部分患者會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且由于缺乏有效的靶向治療手段，導(dǎo)致預(yù)后不良。對(duì)于PTC發(fā)病分子機(jī)制的研究已經(jīng)揭示了相當(dāng)數(shù)量的遺傳改變的參與，包括原癌基因、腫瘤抑制因子[2]、非編碼RNA[3]等的發(fā)現(xiàn)為新靶向治療的研究提供了新的見(jiàn)解。LncRNA DLG1-AS1是最近在宮頸癌中新鑒定的致癌因子[4]。通過(guò)分析癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)集，我們觀察到DLG1-AS1在多種腫瘤組織包括PTC組織中表達(dá)上調(diào)。而且通過(guò)初步RNA測(cè)序分析表明，DLG1-AS1存在與miR-203靶向結(jié)合的互補(bǔ)序列。miR-203是一種在PTC組織中特異性低表達(dá)的腫瘤抑制性miRNA[5]。因此，在本研究中，我們選擇PTC細(xì)胞B-CPAP為研究對(duì)象，旨在探討lncRNA DLG1-AS1/miR-203/靶基因軸在PTC細(xì)胞惡性化生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中的作用，以期為PTC的診斷和治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

PTC細(xì)胞TPC1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3和正常甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫(kù)；PRMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司；pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol Plus RNA純化試劑和mirVana miRNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PrimeScriptTM RTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒購(gòu)自大連寶生生物科技有限公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR購(gòu)自美國(guó)Genecopoeia公司；CCK-8溶液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；胰蛋白酶、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 配膠試劑盒、免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑 ECL購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；DLG1-AS1小分子干擾RNA(siRNAs)和陰性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；miR-203抑制物和陰性對(duì)照序列購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；免疫印跡一抗ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin和二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

分別將TPC1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3、Nthy-ori3-1細(xì)胞培養(yǎng)在PRMI 1640完全培養(yǎng)基(PRMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清按9∶1比例配制PRMI 1640完全培養(yǎng)基，另加入青霉素100 U·ml-1和鏈霉素100 mg·ml-1)中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的B-CPAP細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體和陰性對(duì)照序列)、shDLG1-AS1組(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-shDLG1-AS1)、shDLG1-AS1+miR-203抑制物組(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-shDLG1-AS1和miR-203抑制物),分別將pcDNA3.1-shDLG1-AS1(2 μg)、pcDNA3.1空載體(2 μg)、mir-203抑制物(50 nmol·L-1)、陰性對(duì)照序列(50 nmol·L-1)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染6孔培養(yǎng)皿中的B-CPAP細(xì)胞(約1×106個(gè)細(xì)胞·ml-1)。空白對(duì)照組細(xì)胞未轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中DLG1-AS1和miR-203的相對(duì)表達(dá)

DLG1-AS1檢測(cè)：TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。用1.0 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μl PCR反應(yīng)體系。熱循環(huán)條件為：95 ℃單循環(huán)30 s，95 ℃ 40 s和58.5 ℃ 30 s循環(huán)40次。miR-203檢測(cè)：采用mirVana miRNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞miRNAs，然后用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行miR-203檢測(cè)。熱循環(huán)條件為：95 ℃單循環(huán)30 s，95 ℃ 40 s和60 ℃ 30 s循環(huán)35次。用2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)，內(nèi)參分別為GAPDH mRNA和小分子U6 mRNA。用于PCR擴(kuò)增的引物序列如下：DLG1-AS1上游5′-CCGAAACTTTCCGCCAAGATG-3′，下游5′-CCTCACTTCCCATTGGCTGAG-3′；miR-203上游5′-GGGGTGAAATGTTTAGGAC-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH上游5′-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3′，下游5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

通過(guò)使用miRcode(http:∥www.mircode.org/)、starBase(http:∥starbase.sysu.edu.cn/index.php)、RegRNA(http:∥regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)聯(lián)合預(yù)測(cè)了通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)可與DLG1-AS1結(jié)合的miRNAs。我們用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè) DLG1-AS1與候選者miR-203的結(jié)合能力。構(gòu)建了野生型和突變型熒光質(zhì)粒psiCheck2-DLG1-AS1-Luc和 psiCheck2-DLG1-AS1-MUT-Luc，并將其與miR-203模擬物共轉(zhuǎn)染至B-CPAP細(xì)胞。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性。同樣，我們利用Targetscan(http:∥www.targetscan.org/vert_71/)、miRDB(http:∥www.mirdb.org/)、RNA22(https:∥cm.jefferson.edu/rna22/)聯(lián)合預(yù)測(cè)了能夠與miR-203直接結(jié)合的靶基因。分別構(gòu)建了野生型和突變型熒光質(zhì)粒psiCheck2-ZEB2-Luc和psiCheck2-ZEB2-MUT-Luc，并與miR-203模擬物共轉(zhuǎn)染。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于96孔板上，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別培養(yǎng)12、24、48、72、96 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值。

1.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力

取1×103個(gè)B-CPAP細(xì)胞重懸于含有1 μg·ml-1絲裂霉素C的RPMI 1640培養(yǎng)基中，接種在上層Transwell小室中(遷移實(shí)驗(yàn))或者預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被的上層Transwell小室中(侵襲實(shí)驗(yàn)，預(yù)先用無(wú)血清1640培養(yǎng)基將50 mg·L-1的Matrigel 1∶4稀釋后，包被Transwell小室底部膜，4 ℃風(fēng)干,水化基底膜)，下層培養(yǎng)基加入10%胎牛血清。培養(yǎng)24 h后，殘留在上膜上的B-CPAP細(xì)胞被完全清除。用甲醇固定移行的B-CPAP細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)至少10個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)

用十二烷基硫酸鈉緩沖液制備總細(xì)胞裂解物，裂解B-CPAP細(xì)胞(1×107個(gè)細(xì)胞)。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白樣本，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。用抗鋅指E盒結(jié)合蛋白2(Zinc finger E-box binding protein 2，ZEB2)、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin抗體進(jìn)行孵育后，用IRdye 800山羊抗兔IgG或IRdye 700山羊抗鼠IgG處理1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Image J軟件(NIH)進(jìn)行灰度掃描、定量，蛋白表達(dá)水平根據(jù)β-actin進(jìn)行標(biāo)化。

a 與Nthy-ori3-1細(xì)胞相比，P<0.05；b 與空白對(duì)照組相比，P<0.05A.各組細(xì)胞DLG-AS1表達(dá)差異；B.各組細(xì)胞miR-203表達(dá)差異；C.干擾DLG-AS1表達(dá)效果驗(yàn)證；D.miR-203抑制物轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證圖1 PTC細(xì)胞和正常甲狀腺上皮細(xì)胞中DLG1-AS1和miR-203的表達(dá)差異

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DLG1-AS1和miR-203在PTC細(xì)胞中的表達(dá)

2.1.1 DLG1-AS1和miR-203在PTC細(xì)胞和正常甲狀腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異 經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)，與正常甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1相比，PTC細(xì)胞TPC1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3中DLG1-AS1相對(duì)表達(dá)量均升高，同時(shí)miR-203相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A、B。B-CPAP細(xì)胞中DLG1-AS1相對(duì)表達(dá)量最高，故而選擇B-CPAP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 與空白對(duì)照組(DLG1-AS1：1.00±0.07；miR-203：1.00±0.10)和陰性對(duì)照組(DLG1-AS1：0.95±0.08；miR-203：1.03±0.10)相比，shDLG1-AS1組DLG1-AS1相對(duì)表達(dá)量(0.41±0.05)下降，同時(shí)miR-203相對(duì)表達(dá)量(1.79±0.21)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與shDLG1-AS1組相比，shDLG1-AS1+miR-203抑制物組miR-203相對(duì)表達(dá)量(0.78±0.08)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1C、D。這些結(jié)果證明轉(zhuǎn)染成功。

2.2 熒光素酶報(bào)告基因分析

使用miRcode、starBase、RegRNA 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)可與 DLG1-AS1結(jié)合的miRNAs，其中miR-203包含在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中。同樣使用Targetscan、miRDB、RNA22 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，ZEB2是miR-203下游重要的靶基因。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告發(fā)現(xiàn)miR-203模擬物降低含有野生型3′UTR的DLG1-AS1的熒光素酶活性，但不降低含有突變型3′UTR的DLG1-AS1的熒光素酶活性(圖2A)；另外miR-203 mimics與ZEB2 3′UTR WT共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，但是并不降低含有MUT 3′UTR的ZEB2 mRNA的熒光素酶活性(圖2B)。證實(shí)DLG1-AS1可以直接與miR-203結(jié)合，同樣miR-203也可以直接與ZEB2 mRNA結(jié)合，突變位點(diǎn)就是這種相互作用的位置。另外根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，LncRNA DLG1-AS1在腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量升高，同時(shí)miR-203在腫瘤中的表達(dá)水平則明顯低于正常組織(圖3)。

a 與空白對(duì)照組相比，P<0.05；b 與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c 與shGLD1-AS1組相比，P<0.05圖4 各組B-CPAP細(xì)胞增殖曲線圖

a 與miR-NC組相比，P<0.05A.DLG1-AS1存在與miR-203靶向結(jié)合序列，經(jīng)熒光素酶報(bào)告分析，DLG1-AS1野生型與miR-203共轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度明顯降低；B.miR-203存在與ZEB2 mRNA靶向結(jié)合序列，經(jīng)熒光素酶報(bào)告分析，ZEB2野生型與miR-203共轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度明顯降低圖2 DLG1-AS1和miR-203靶基因的篩選和驗(yàn)證

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索DLG1-AS1和miR-203在PTC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異

2.3 干擾DLG1-AS1表達(dá)對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖活性的影響

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，shDLG1-AS1組B-CPAP細(xì)胞增殖活性顯著降低(均P<0.05)；但是與shDLG1-AS1組相比，shDLG1-AS1+miR-203抑制物組B-CPAP細(xì)胞增殖活性則顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.4 干擾DLG1-AS1表達(dá)對(duì)B-CPAP細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響

與空白對(duì)照組[遷移細(xì)胞數(shù)量(523±93)個(gè)·視野-1，侵襲細(xì)胞數(shù)量(368±49)個(gè)·視野-1]和陰性對(duì)照組[遷移細(xì)胞數(shù)量(514±59)個(gè)·視野-1，侵襲細(xì)胞數(shù)量(358±33)個(gè)·視野-1]相比，shDLG1-AS1組B-CPAP細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量[(227±41)個(gè)·視野-1]和侵襲細(xì)胞數(shù)量[(149±28)個(gè)·視野-1]均明顯減少(均P<0.05)；但是與shDLG1-AS1組相比，shDLG1-AS1+miR-203抑制物組B-CPAP細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量[(369±26)個(gè)·視野-1]和侵襲細(xì)胞數(shù)量[(237±43)個(gè)·視野-1]則顯著增多(均P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察干擾DLG1-AS1表達(dá)對(duì)B-CPAP細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響 ×100

2.5 干擾DLG1-AS1對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，shDLG1-AS1組中ZEB2、N-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)E-cadherin表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)。與shDLG1-AS1組相比，shDLG1-AS1+miR-203組中ZEB2、N-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)E-cadherin表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖6。

圖6 干擾DLG1-AS1表達(dá)對(duì)B-CPAP細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

甲狀腺癌的發(fā)病率在頭頸部腫瘤中居首位，可分為PTC、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌4種亞型，其中PTC約占甲狀腺癌的80%，常見(jiàn)于女性人群[1]。LncRNA是高度保守的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸序列。與miRNAs相比，LncRNAs具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和多樣的表達(dá)調(diào)控。研究表明LncRNAs在蛋白質(zhì)功能調(diào)控、基因印跡、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[6]。而且在PTC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，LncRNAs已成為新的治療目標(biāo)以及診斷和預(yù)后標(biāo)志物[7]。在本研究中，我們證實(shí)LncRNA DLF1-AS1可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，與 mRNA的3′UTR中的miR-203識(shí)別元件結(jié)合，釋放出miR-203,對(duì)下游靶基因ZEB2 mRNA進(jìn)行抑制或降解，從而調(diào)節(jié)ZEB2蛋白以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。

PTC的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，受到多種癌基因、抑癌基因或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響[8]。最近很多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注LncRNA DLG1-AS1在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式和功能。例如Rui等[4]學(xué)者證實(shí)DLG1-AS1在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，可以通過(guò)吸附miR-107進(jìn)而上調(diào)致癌基因ZHX1的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。Li[9]發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌組織和MCF-10A細(xì)胞中，DLG1-AS1相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移活性；其作用機(jī)制與介導(dǎo)miR-203表達(dá)下調(diào)有關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DLG1-AS1在PTC細(xì)胞(TPC1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3細(xì)胞)中的表達(dá)水平也較正常甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1明顯升高，尤其以B-CPAP細(xì)胞中DLG1-AS1表達(dá)量升高最明顯。由于我們后續(xù)需要敲低DLG1-AS1表達(dá)，以證實(shí)其在PTC細(xì)胞惡性化生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用，因此我們選擇表達(dá)量最高的B-CPAP細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過(guò)干擾DLG1-AS1表達(dá)，B-CPAP細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活性顯著降低，說(shuō)明DLG1-AS1也在PTC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著致癌作用，DLG1-AS1過(guò)表達(dá)可能是促進(jìn)PTC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良的重要分子機(jī)制之一。

非編碼RNA(ncRNA)是轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵組成部分，在正常的生物學(xué)活性和病理過(guò)程(如病毒感染和腫瘤發(fā)生)中均起著重要作用[10]。LncRNA和miRNA是ncRNA的最重要元素，并起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。lncRNA可以通過(guò)與miRNA的互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[11]。miR-203基因序列定位于染色體14q32.33上，該區(qū)域是染色體上的不穩(wěn)定區(qū)域，編碼了約12%的人類mRNA。最近更多的研究表明miR-203是一個(gè)關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，參與了包括PTC、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)病機(jī)制[12-14]。Wu等[15]觀察到miR-203在PTC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，而且miR-203表達(dá)下調(diào)與survivin的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，因此miR-203在PTC中具有生物標(biāo)志物的功能，可作為治療PTC新型治療策略的候選靶點(diǎn)。此外，You等[16]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-203表達(dá)可抑制AKT3蛋白表達(dá)，不僅可降低荷瘤小鼠模型的腫瘤體積和重量，而且也可抑制體外TPC-1細(xì)胞的遷移、集落形成、增殖和侵襲活性以及增殖相關(guān)蛋白(ki67和CDK4)、侵襲和遷移相關(guān)蛋白(MMP-2和MMP-9)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)和降低間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin蛋白的表達(dá)。在本研究中，我們證實(shí)miR-203通過(guò)阻斷EMT相關(guān)信號(hào)因子抑制B-CPAP細(xì)胞的遷移、侵襲活性，包括降低ZEB2、N-cadherin、vimentin、β-catenin的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)E-cadherin蛋白表達(dá)。

ZEB2是促進(jìn)很多腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。Kan等[17]觀察到，過(guò)表達(dá)miR-335通過(guò)靶向抑制ZEB2表達(dá)進(jìn)而抑制PTC腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移活性。在本研究中，我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選、實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，進(jìn)一步確定ZEB2是miR-203調(diào)控的靶基因。EMT是上皮細(xì)胞經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)變獲得間充質(zhì)表型以促進(jìn)遷移和侵襲的過(guò)程。EMT的激活引發(fā)上皮標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)以及間充質(zhì)標(biāo)志物(N-cadherin、vimentin、β-catenin)表達(dá)增加。而E-cadherin的缺失主要是由ZEB2轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的，ZEB2通過(guò)與E-cadherin(CDH1)基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件結(jié)合，上調(diào)組蛋白去乙?；富钚院腿旧|(zhì)縮合阻遏E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而啟動(dòng)EMT過(guò)程。在本研究中，我們觀察到干擾GLD1-AS1表達(dá)后，B-CPAP細(xì)胞的ZEB2蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、vimentin、β-catenin表達(dá)降低，因此抑制EMT過(guò)程可能是干擾GLD1-AS1表達(dá)抑制B-CPAP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲活性的重要機(jī)制。

綜上所述，LncRNA DLG1-AS1通過(guò)與miR-203競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，消除miR-203對(duì)靶基因ZEB2表達(dá)的抑制，促進(jìn)PTC細(xì)胞發(fā)生EMT，這可能是PTC惡性化生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。因此，LncRNA DLG1-AS1/miR-203/ZEB2軸可作為PTC診斷和治療的潛在分子靶點(diǎn)。