利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定津甜100甜瓜種子純度

武云鵬 李肯 張若緯 彭冬秀

摘 要：利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定甜瓜種子純度，是甜瓜種子生產(chǎn)、銷(xiāo)售過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。利用津甜100親本對(duì)24對(duì)甜瓜SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到多態(tài)性高、在F1代中條帶差異較大的2對(duì)引物。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)F1群體進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，純度均為99.0%。因此， 筆者篩選得到多態(tài)性高、條帶差異大的2對(duì)引物，可鑒定津甜100甜瓜種子。

關(guān)鍵詞：甜瓜;分子標(biāo)記;引物;快速檢測(cè)

Abstract： Identification of the melon seeds purity by SSR molecular marker technology is the key link in the process of melon seeds production and sales. I24 pairs of SSR primers of oriental melon were used to screen for the polymorphism of Jintan 100 parents， 2 pairs of primers with high polymorphic in F1 generation were obtained. The purity of F1 population was identified by polyacrylamide gel electrophoresis using the 2 pairs， the molecular identification results were consistent with the field identification results， and the purity was 99%. Therefore， two pairs of primers with high polymorphism were screened to identify Jintian 100 oriental melon seeds.

Key words： Melon; Molecular marker; Purity; Rapid detection

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物，香甜可口，肉質(zhì)酥脆多汁，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。隨著人們生活水平的提高，對(duì)高品質(zhì)甜瓜的需求也逐年增加[1]，因此促進(jìn)了甜瓜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。眾所周知，市場(chǎng)銷(xiāo)售的甜瓜種子大多數(shù)為雜交種，在甜瓜雜交種商品化繁殖過(guò)程中，由于去雄不徹底或人工失誤摻入雜種，使得雜交種純度下降，給種植戶(hù)造成不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失，因此也制約了產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[2]。當(dāng)前，對(duì)于甜瓜雜交種純度的鑒定多采用田間形態(tài)鑒定，不僅費(fèi)工、耗時(shí)，還易受環(huán)境等外界因素的影響，從而降低鑒定結(jié)果的可靠性[3]。綜上所述，制定一套簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的甜瓜雜交種種子真實(shí)性的檢測(cè)方法，對(duì)提高種子質(zhì)量、降低種子檢測(cè)成本和縮短檢測(cè)周期具有重要意義。

近些年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展， DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物雜交種子純度鑒定工作中[4]，前人已經(jīng)將RAPD標(biāo)記應(yīng)用于甜瓜品種鑒定中，但多數(shù)RAPD標(biāo)記表現(xiàn)為顯性，不能區(qū)分雜合子[5]。而SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，對(duì)DNA質(zhì)量要求較低，能很好地區(qū)分雜交種與父、母本條帶的差異，因此SSR標(biāo)記可廣泛應(yīng)用于甜瓜雜交種純度和真實(shí)性的鑒定工作中。前人研究結(jié)果顯示，應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定甜瓜雜交種真實(shí)性主要應(yīng)用于厚皮甜瓜中，而在薄皮甜瓜中還少有報(bào)道[6-9]。因此，筆者利用薄皮甜瓜津甜100雜交種及親本對(duì)24對(duì)甜瓜SSR核心引物進(jìn)行篩選及多態(tài)性檢測(cè)，以期獲得一套簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的SSR標(biāo)記技術(shù)體系，用于津甜100甜瓜雜交種種子純度鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

于2019年在天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所試驗(yàn)基地和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)材料為天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所甜瓜研究室培育的甜瓜雜交種津甜100及其親本，共計(jì)3份薄皮甜瓜材料。3月初溫室播種育苗，津甜100播種100株，父、母本各20株，4月初定植于連棟冷棚，平畦地膜覆蓋，常規(guī)栽培管理。

實(shí)驗(yàn)藥品為DNA試劑盒（康為），Taq Master Mix（康為），10×TBE（Solarbio），40%丙烯酰胺（Solarbio），TEMED（Solarbio），10×Loading Buffer（寶生物）;24對(duì)引物（表1）序列由天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所蘭青闊老師提供，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 甜瓜親本DNA提取采用康為DNA試劑盒法，取100 mg新鮮嫩葉加入液氮充分研磨，研磨后立即加入400 μL Buffer LP1和RNase（10 mg?mL）漩渦震蕩1 min，室溫靜置1 min。然后加入130 μL Buffer LP2混勻，漩渦震蕩1 min后，12 000 r?min-1離心5 min，將上清液移至新的離心管中。加入1.5倍體積的Buffer LP3充分混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至組裝的吸附柱中12 000 r?min-1離心1 min，倒掉廢液，將吸附柱放回試管中，再向吸附柱加入500 μL Buffer GW2并12 000 r?min-1離心3 min，倒掉廢液，將吸附柱靜置15 min晾干水分。最后將吸附柱放入新的1.5 mL離心管中，向吸附柱懸空加入100 μL Buffer GE，室溫放置5 min，12 000 r?min-1離心1 min，收集DNA溶液-20 ℃保存。

津甜100雜交種DNA提取采用堿煮法，取新鮮嫩葉100 mg于2 mL離心管中，加入鋼珠和100 μL NaOH（濃度為0.4 mol?L-1）溶液，在組織破碎儀中研磨粉碎后，將離心管放入沸水中煮1 min，離心后取上清液10 μL加入100 mmol?L-1 Tris緩沖液（pH 8.0）100 μL，混勻待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系 采用王利英等[10-11]PCR反應(yīng)體系，共10 μL，包括：5 μL Taq Master Mix（康為），2 μL ddH2O，2 μL模板DNA（質(zhì)量濃度為100 ng?μL-1），上下游引物各0.5 μL（濃度為10 pmol?μL-1）。

PCR擴(kuò)增程序 94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s;循環(huán)34次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.2.3 電泳及銀染檢測(cè) 采用垂直電泳槽，電泳緩沖液為0.5XTBE，8%（w）非變性聚丙烯酰胺凝膠，電壓為150 V電泳2 h后，對(duì)凝膠進(jìn)行銀染，步驟為：固定-凝膠浸泡于0.5%冰醋酸（900 mL H2O+100 mL 無(wú)水乙醇+5 mL冰醋酸）溶液，搖床輕搖6 min;染色-過(guò)濾固定液，加入0.5%硝酸銀溶液（1000 mL H2O+2 g AgNO3），輕搖8 min;清洗-過(guò)濾染色液，加入蒸餾水清洗30 s;顯影-加入顯影液（1000 mL H2O+15 g NaOH+3 mL甲醛）搖床輕搖，直至出現(xiàn)清晰條帶，加入甲醛時(shí)，必須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行;漂洗-過(guò)濾顯影液，加入蒸餾水輕搖1 min，最后用保鮮膜包好，在燈箱觀測(cè)結(jié)果并拍照記錄。

1.2.4 引物篩選及品種鑒定 利用親本對(duì)24對(duì)引物進(jìn)行特異譜帶篩選，選出譜帶清晰、特異性高的共顯性引物，并利用該引物在津甜100的100個(gè)單株間進(jìn)行測(cè)試，記錄帶型表現(xiàn)，最后與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

利用津甜100父、母本對(duì)24對(duì)引物進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖1。每對(duì)引物占4個(gè)條帶，父、母本分別占2個(gè)條帶。從圖中可以看出，JT-14、JT-22和JT-24在雙親之間顯示出特異性條帶。而JT-14和JT-22的條帶清晰，雙親差異明顯，因此可用于津甜100甜瓜種子純度鑒定。

2.2 利用共顯性標(biāo)記引物進(jìn)行津甜100雜種鑒定

利用引物JT-14和JT-22對(duì)100株津甜100雜交種進(jìn)行純度鑒定，部分單株SSR電泳圖譜如圖2所示。第30號(hào)雜交種表現(xiàn)為母本帶型，其余均為雙親互補(bǔ)帶型，因此可推算出津甜100雜交種純度為99.0%。與此同時(shí)，對(duì)田間種植的雜交種進(jìn)行田間形態(tài)鑒定，發(fā)現(xiàn)第30號(hào)植株表現(xiàn)為母本性狀，其余均為雜交種性狀。由此說(shuō)明，利用分子標(biāo)記法進(jìn)行甜瓜種子純度鑒定結(jié)果和田間形態(tài)鑒定結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

雜交種純度和真實(shí)性鑒定是蔬菜種子質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中一個(gè)非常重要的檢測(cè)項(xiàng)目[12]。傳統(tǒng)的甜瓜種子純度主要依賴(lài)于田間形態(tài)鑒定，鑒定周期長(zhǎng)，易受環(huán)境和人為主觀因素影響，最終結(jié)果的準(zhǔn)確性不高，從而影響良種及時(shí)銷(xiāo)售，使種子公司遭受巨大損失。因此，探索一套簡(jiǎn)易、快速、準(zhǔn)確的甜瓜種子純度鑒定體系，對(duì)甜瓜良種的銷(xiāo)售具有重要意義。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已在甜瓜中廣泛應(yīng)用。DNA指紋圖譜已成為準(zhǔn)確鑒定品種的有力工具[13]，其中SSR分子標(biāo)記因操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、呈共顯性標(biāo)記，已經(jīng)被廣大學(xué)者用于種子純度和真實(shí)性檢測(cè)。姜陸等[14]利用2.5%（w）瓊脂糖凝膠技術(shù)鑒定西州密17號(hào)甜瓜種子純度，具有制膠簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，常用于DNA樣本分析，但是，筆者采用的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有成本低、一次性檢測(cè)樣本量大、所用設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、不使用有毒的熒光染劑等優(yōu)點(diǎn)，常被廣大學(xué)者所應(yīng)用。在種子生產(chǎn)過(guò)程中，由于母本去雄不徹底而摻入自交種是雜種的主要來(lái)源，但是，由于棚室密封不嚴(yán)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)帶入外源花粉，也可以產(chǎn)生種間混雜。因此，利用多對(duì)引物對(duì)雜交種進(jìn)行鑒定，通過(guò)對(duì)結(jié)果進(jìn)行校對(duì)，能更有效、直觀地計(jì)算雜交種的純度，而李超等[15-17]學(xué)者利用單一引物鑒定甜瓜種子純度，有可能因?yàn)樵囼?yàn)失誤導(dǎo)致最終結(jié)果不準(zhǔn)確。但是，利用多對(duì)特異性引物組合進(jìn)行鑒定僅在西瓜中有少量報(bào)道[18]，在甜瓜種子鑒定工作中鮮有報(bào)道。因此筆者通過(guò)2對(duì)特異性引物構(gòu)建PCR體系，對(duì)甜瓜津甜100進(jìn)行種子純度鑒定，使鑒定結(jié)果更加清晰明確，提高了鑒定的準(zhǔn)確性與工作效率。

建立一套簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的SSR標(biāo)記技術(shù)體系，不僅能夠驗(yàn)證甜瓜雜交種純度和真實(shí)性，還能為建立甜瓜DUS測(cè)試、良種市場(chǎng)監(jiān)督管理及新品種自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐[19]。

利用津甜100雙親對(duì)24對(duì)甜瓜引物進(jìn)行篩選，得到2對(duì)在雙親間表現(xiàn)出特異性并且條帶清晰、差異明顯的引物JT-14和JT-22，并通過(guò)8%（w）丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)100份雜交種進(jìn)行檢測(cè)，最終鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果一致。因此，利用這2對(duì)特異性引物可對(duì)津甜100雜交種進(jìn)行純度鑒定。

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