一種甜瓜新癥狀病害的病原鑒定及其生物學(xué)特性

耿麗華 王建設(shè) 馬建 楊洋 史越 宋順華

摘 要：2018年在北京通州試驗基地的一溫室內(nèi)發(fā)生一種甜瓜新癥狀病害，為了能夠有效地控制該病害，采集典型發(fā)病植株進行病原菌分離純化，測定其致病性;利用形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS序列分析法鑒定該病原菌種類，并測定其部分生物學(xué)特性。結(jié)果表明，該病原菌為尖孢鐮刀菌甜瓜專化型Fusarium oxysporum f. sp melonis。該病原菌在查彼克培養(yǎng)基（Czapek）上生長最快，最適生長溫度為25～30 ℃，比較適合的碳源為甘露醇、麥芽糖和葡萄糖，比較適合的氮源為酵母浸膏。該病原菌對光照不敏感，菌絲致死溫度為68 ℃下10 min。通過分析病害的發(fā)生特點，推測這種病害初侵染源可能是種子攜帶的病原菌。

關(guān)鍵詞：甜瓜;病害新癥狀;病原鑒定;尖孢鐮刀菌;生物學(xué)特性

Abstract： A new symptom disease of melon（Cucumis melo L.）was observed in a greenhouses in Tongzhou ， Beijing in 2018. In order to promote the study of controlling measures to the disease ， the typical diseased plants were collected and the pathogen was isolated， and the pathogen was identified on its morphology and rDNA ITS sequence analysis. The biological characteristics of the pathogen growth were also studied. The results showed that the pathogen of this disease was Fusarium oxysporum f.sp melonis. The pathogen grows fastest on Czapek medium. The optimal temperature for the pathogen to grow on PDA is 25-30 ℃. The pathogen grows faster with mannitol， maltose， and glucose as carbon sources， and with yeast extract as nitrogen sources. The pathogen was insensitive to light. The mycelium lethal temperature is 68 ℃ for 10 minutes. By analyzing the characteristics of this disease ， the primary infection source of the disease may come from the seeds with the pathogen.

Key words： Melon; New symptom disease; Pathogen identification; Fusarium oxysporum; Biological characteristics

甜瓜（Cucumis melo L.） 是我國重要的瓜類經(jīng)濟作物之一，因其口感好，營養(yǎng)價值高，在我國設(shè)施栽培中的面積越來越大，隨之而來的是病害發(fā)生情況也越來越復(fù)雜。往往同一種病原菌侵染會產(chǎn)生不同發(fā)病癥狀，而不同病原菌導(dǎo)致的病害有時又會表現(xiàn)相似的癥狀，給準確識別病害帶來困難，無法準確防治病害導(dǎo)致人力物力的浪費，同時，病情得不到有效控制又會造成減產(chǎn)。2018年5月，筆者發(fā)現(xiàn)在北京通州試驗基地的一個甜瓜品種比較試驗溫室內(nèi)發(fā)生了一種甜瓜病害。該病害發(fā)病初期先從植株上中部莖開始一側(cè)縱裂，莖裂處有紅褐色分泌物流出，莖縱裂從上往下向基部發(fā)展，嚴重時莖病部褐化，葉片萎蔫，植株枯死。這種病害與以往報道的瓜類蔓枯病相似，但使用針對蔓枯病的藥劑不能控制該病害，最先發(fā)病的品種生長中期100%死亡。為了弄清楚該病害的病原種類，筆者采集典型發(fā)病植株進行病原菌分離純化，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進行病原菌鑒定，測定其生物學(xué)特性，并分析其可能的傳播途徑，為進一步防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病樣：2018年5月從北京通州試驗基地溫室采集具有典型發(fā)病癥狀的甜瓜地上部植株。

試劑及儀器：真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、高純度的dNTP、Taq DNA擴增酶、10×Buffer、DNA Marker Ⅱ、引物及其緩沖液（北京新時代眾合科技有限公司）;其他無機試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。PRX-450D-30恒溫光照培養(yǎng)箱（浙江聯(lián)合賽福實驗儀器科技有限公司）;MJ-150 F-1霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;C1000 PCR儀（美國 BIO-RAD 公司）;DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）;Olympus BX51顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂17 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL;康乃馨水瓊脂培養(yǎng)基（carnation leaf agar，CLA）：瓊脂20 g，蒸餾水1 L，每個9 cm直徑的培養(yǎng)基平板上加入大小約為4 mm2的康乃馨葉片6～8塊;查彼克培養(yǎng)基（Czapek）：KNO3 2 g、K2HPO4 1 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂17 g、蒸餾水1000 mL;燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（oat meal agar，OA）：燕麥片30 g、瓊脂30 g、蒸餾水1000 mL;玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（corn meal agar，CMA）：玉米粉300 g、瓊脂 17 g、蒸餾水1000 mL;馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，所有培養(yǎng)基使用之前均于120 ℃高壓滅菌20 min備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用常規(guī)組織分離法[1]。從典型發(fā)病植株的病健交界處取小塊組織，在75%乙醇溶液中浸泡2～3 s，然后用滅菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，放在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將分離菌株單孢純化后轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離物致病性測定 采用柯赫氏法則對分離菌株進行致病性驗證。分別取成株期的甜瓜、西瓜和南瓜健康植株莖段及葉柄進行表面消毒，將接種點設(shè)在莖段及葉柄的中間部位，用滅菌的解剖刀在擬接種部位切下表皮層約5 mm×5 mm的面積，然后接種直徑為5 mm的菌餅，以不接種菌餅的莖段及葉柄作為對照，擺放在滅菌的搪瓷盤內(nèi)，加保鮮膜覆蓋保濕，放入25 ℃的光照培養(yǎng)箱中，觀察發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將純化的病原菌接種到PDA平板上，25 ℃暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)并測量其7 d的生長速率;將病原菌接種到在CLA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)，觀察大型分生孢子和小型分生孢子，在100倍倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式并拍照。然后，依據(jù)Leslie & Summerell[2]相關(guān)分類方法進行種類鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：將病原菌接種到PDA平板上，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，收集菌絲體，加液氮研磨成粉末，用真菌基因組提取試劑盒提取其DNA。用真菌通用引物 ITS1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[3]對病原菌rDNA的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）進行PCR擴增。反應(yīng)體系及擴增方法參照耿麗華等[4]的方法進行。擴增片段由北京新時代眾合科技有限公司進行測序，將得到的序列在NCBI中檢索同源性序列，采用MEGA 7.0軟件用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自舉法（Bootstrap）對發(fā)育樹進行1000次重復(fù)檢驗。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測定 在病原菌生物學(xué)特性測定中，使用培養(yǎng)7 d的病原菌菌落，用5 mm打孔器在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌餅，將其置于不同處理試驗的培養(yǎng)基平板中央，除光照對病原菌生長的影響試驗外，均在25 ℃條件下暗培養(yǎng)。每個處理1個平板，5次重復(fù)。

不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響：設(shè)PDA、PSA、Czapek、OA和CMA共5種培養(yǎng)基處理。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)菌餅5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

溫度對病原菌生長的影響：將放置菌餅的PDA平板分放在5、10、15、20、25、28、30、35 ℃條件下暗培養(yǎng)。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

不同碳源對病原菌生長的影響：以Czapek為基礎(chǔ)，分別用等量的乳糖（C12H22O11）、麥芽糖（C12H22O11·H2O）、淀粉（C6H10O5）n、葡萄糖（C6H12O6）、半乳糖（C6H12O6）、甘露醇（C6H14O6）和果糖（C6H12O6）代替Czapek中30 g蔗糖（C12H22O11），配制成不同碳源的培養(yǎng)基。不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)菌餅5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

不同氮源對病原菌生長的影響：以Czapek為基礎(chǔ)，分別用等量的尿素（CH4N2O）、蛋白胨、氯化銨（NH4Cl）、酵母浸膏、乙酸銨（CH3COONH4）、賴氨酸（C6H14N2O2）以及甘氨酸（C2H5NO2）代替Czapek中2 g KNO3，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)菌餅5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

光照對病原菌生長的影響：光源為普通日光燈（28 W，距離30 cm），設(shè)連續(xù)光照24 h（L24）、連續(xù)黑暗（D24）和12 h光暗交替（L12/D12）3個處理。將放置菌餅的PDA平板在不同光照條件下培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

菌絲致死溫度測定：將10個病原菌菌餅放入滅菌試管中，將試管分別放入40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中處理10 min，冷卻降溫后每處理隨機取出5個菌餅，分別轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長情況。確定致死溫度范圍后，再在此范圍內(nèi)進一步設(shè)置濃度梯度試驗，以確定致死溫度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將生物學(xué)特性數(shù)據(jù)錄入Excel表格，分析各處理的標準差，采用SPSS 13.0單向方差分析模型（one-way ANOVA model）檢驗平均數(shù)差異顯著性（Student- Newman-Keuls）。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀觀察與病原菌分離純化

由圖1可以看出，病害的初始癥狀為發(fā)病植株上、中部莖出現(xiàn)側(cè)裂，仔細觀察可見縱裂處有紅褐色顆粒狀物，有的從縱裂處流出紅褐色分泌物，順莖蔓滴落;然后莖蔓縱裂向莖基部擴展，濕度大時縱裂處長出白色菌層;切開發(fā)病植株的莖部可見病部褐化;當(dāng)葉片表現(xiàn)萎蔫時挖出根部，發(fā)現(xiàn)根系生長正常、沒有任何病變。

取莖部病健交接處，按常規(guī)方法進行病原菌分離，挑取單孢進行純化。先后幾次取樣分離，均長出唯一一種真菌，分離得到一種分離物，定名為TGT180522-1。

2.2 分離物致病性測定

由圖2可以看出，甜瓜莖段和葉柄接種致病菌后2 d，明顯可見接種的莖段及葉柄上菌絲生長，5 d時，接種的莖段及葉柄上菌絲快速增長、莖段及葉柄出現(xiàn)褐化，8 d時，接種的莖段及葉柄幾乎完全褐化，而對照仍然保持完好，與田間自然發(fā)病癥狀一致。從發(fā)病的部位進行再分離和純化，所得菌株與所測定的分離物在培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征上相同，因而確定該分離物是病原菌。

西瓜和南瓜莖段上接種該病原菌后8 d，接種的西瓜、南瓜莖段上沒有菌絲生長，與對照一樣仍然保持完好。說明該病原菌能侵染甜瓜，不能侵染西瓜和南瓜。