藏藥九味麝香丸抗炎及免疫干預(yù)作用研究*

米瑪卓嘎 賽悟杰 次仁德吉 扎西瓊達(dá)

（西藏自治區(qū)藏醫(yī)院科研處，西藏 拉薩 850000）

藏藥九味麝香丸系以19世紀(jì)藏醫(yī)名家貢追·云登加措所著《臨床札記·札記精粹》[1]中的藏藥九味黑藥丸為基礎(chǔ)，根據(jù)疫病發(fā)病機(jī)制和臨床表象，在名老藏醫(yī)專家貢覺(jué)旺堆指導(dǎo)下，按照藏醫(yī)辯證施治、臨證加減配方的用藥指導(dǎo)原則，通過(guò)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院專家論證后確定。該配方由麝香、訶子、牛黃等九味藥材組成，具有消炎、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)之功效，用于各類疫病包括其他炎癥性疾病引起的頭痛、發(fā)熱、咳嗽，正氣不足，亦可用于中風(fēng)、炭疽等病癥?？蓛?nèi)服也可外用，既可單獨(dú)使用，也可與其他藥物搭配使用。本文采用經(jīng)典藥效學(xué)方法，研究藏藥九味麝香丸的抗炎和免疫干預(yù)作用，以期為臨床用藥提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物

1.1.1 供試藥物藏藥九味麝香丸為訶子、牛黃、麝香等九種藥材粉碎后制成的水泛丸，由本院制劑室自制，批號(hào)20200310，制劑規(guī)格為0.9g～1.1g/10 丸。臨用稱取適量藥丸，粉碎，加水研磨配至所需濃度即為試驗(yàn)樣品。

1.1.2 陽(yáng)性對(duì)照品。醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：170826；鹽酸左旋咪唑，山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170407；環(huán)磷酰胺，百特國(guó)際有限公司，批號(hào)：7J194A；玉屏風(fēng)顆粒，國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)：191123。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種小鼠220 只，雄性160 只，雌性60只，試驗(yàn)體重18g～22g，四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-19；豚鼠，6只，雌雄各半，體重250g～350g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；公雞，市售。

1.3 主要試劑

二甲苯，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2017 022701；烏來(lái)糖，成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：20 130323；戊巴比妥鈉，sigma，批號(hào)：93ET2904K；DNFB，SIGMA，批號(hào)：BCBH8982V；文齊氏液，天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所，批號(hào)：20 190415；一水葡萄糖，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2014 082701；氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20 120504；二水合檸檬酸三鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20 130328；一水合檸檬酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20 140112；氯化鈉注射液，安徽豐原藥業(yè)股份有限公司淮海藥廠，批號(hào)：181022107。

1.4 主要儀器

電子天平LD6100-1，d=0.1g，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；電子天平，BSA223S，d=1mg，賽多利斯；移液槍，5uL～50uL，F(xiàn)innpipette；離心機(jī)，Centrfuge5430，eppendorf；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，Varioskan Flash，Thermo。

1.5 方法

1.5.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響[2-3]KM小鼠50只，雄性，動(dòng)物按體重分層隨機(jī)均分為5 組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、醋酸地塞米松片組（2.466mg/kg）、九味麝香丸高劑量組（0.20g/kg）、中劑量組（0.10g/kg）和低劑量組（0.05g/kg）。按0.1mL/10g 灌胃給予供試品、對(duì)照品或純水，每日1 次，連續(xù)7 日。末次藥后40min，于小鼠右耳兩面涂抹二甲苯25uL，20min 后20%烏來(lái)糖生理鹽水溶液按25mL/kg腹腔注射處死動(dòng)物。沿小鼠耳廓基沿剪取左右兩耳，稱重，計(jì)算腫脹度（右耳重量-左耳重量）和腫脹抑制率（（模型對(duì)照組平均腫脹度-受試組或其他對(duì)照組平均腫脹度）/模型對(duì)照組平均腫脹度）。[2-3]

1.5.2 對(duì)小鼠棉球肉芽腫生成的影響[4]KM 小鼠50只，雄性，動(dòng)物按體重分層隨機(jī)均分為5 組，每組10 只，分別為模型對(duì)照組、醋酸地塞米松片組（2.466mg/kg）、九味麝香丸高劑量組（0.20g/kg）、中劑量組（0.10g/kg）和低劑量組（0.05g/kg）。給藥首日，小鼠用80mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后于左右腋下植入消毒棉球（5mg）各一粒。按0.1mL/10g 灌胃給予供試品、對(duì)照品或純水，每日1次，連續(xù)7日。末次給藥后1h，20%烏來(lái)糖生理鹽水溶液按25mL/kg 腹腔注射處死動(dòng)物，取出左右腋下棉球在60℃烤箱放置12h 后稱重，以給藥后棉球的干重減原棉球重量作為肉芽腫的干重。[4]

1.5.3 對(duì)DNFB 所致小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響[5]KM小鼠60 只，雌雄各半，動(dòng)物分性別按體重分層隨機(jī)均分為6 組，每組10 只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、玉屏風(fēng)顆粒組（3.08g/kg）、九味麝香丸高劑量組（0.20g/kg）、中劑量組（0.10g/kg）和低劑量組（0.05g/kg），按0.1ml/10g 灌胃給予供試品、對(duì)照品或純水，每日1次，連續(xù)13 日（D1-D13）。于給藥第8 天（D8）小鼠腹部皮膚去毛，面積約2cm×2cm；第9 天（D9）給藥后1小時(shí)，除空白對(duì)照組外，以2%DNFB 溶液25ul 涂抹于腹部，隔天增強(qiáng)再同法涂抹一次，空白對(duì)照組代以1：1丙酮-花生油溶液。給藥第13日（D13）藥后1小時(shí)，取10uL 2%DNFB 溶液涂抹小鼠右耳；24 小時(shí)后腹腔注射烏來(lái)糖處死小鼠，沿耳廓線剪下鼠耳，稱重，計(jì)算耳腫脹度；取胸腺和脾稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。[5]

1.5.4 對(duì)雞紅細(xì)胞所致小鼠溶血素生成的影響[6]KM小鼠60 只，雌雄各半，動(dòng)物按體重分層隨機(jī)均分為6組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、免疫低下模型對(duì)照組、鹽酸左旋咪唑組（20.55g/kg）、九味麝香丸高劑量組（0.20g/kg）、九味麝香丸中劑量組（0.10g/kg）、九味麝香丸低劑量組（0.05g/kg）。按0.1mL/10g 灌胃給予供試品、對(duì)照品或純水：除陽(yáng)性對(duì)照組外，均為每日1次，連續(xù)13 日（D1-D13）；陽(yáng)性對(duì)照組D7-D9 每日1次、連續(xù)3日給予鹽酸左旋咪唑懸液，其余時(shí)間給予純水，每日1次。給藥第7日（D7）以5%雞紅細(xì)胞混懸液腹腔注射0.2mL/只進(jìn)行免疫；免疫結(jié)束前2 天（D10，D11），除模型對(duì)照組外，其余各組小鼠以環(huán)磷酰胺造模兩次，劑量為每次30mg/kg。免疫第7 天（D13），小鼠眼眶采血20uL/只，加入已盛有1mL 生理鹽水的試管中，再分別加入4%雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液和10%豚鼠血清0.5mL，充分混勻，置37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)。0.5h 后取出并置冰水浴中以終止反應(yīng)。待試管冷卻，離心，取上清液1mL，加入3mL 都氏液，放置10min后在540nm 處比色，以上述都氏液為空白調(diào)零，測(cè)定各管光密度。[6]

1.5.5 統(tǒng)計(jì)方法。采用SPSS23.0 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：結(jié)果以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（）描述；如符合正態(tài)分布，進(jìn)行單因素方差分析，否則進(jìn)行K-W 非參數(shù)檢驗(yàn)；單因素方差分析時(shí)，如方差齊性，采用LSD 檢驗(yàn)，如方差不齊，采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果

九味麝香丸0.20g/kg、0.10g/kg組耳腫脹度降低，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），腫脹抑制率分別為32%和20%，提示該劑量九味麝香丸具有抑制急性炎癥藥效。

表1 九味麝香丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹試驗(yàn)的影響（n=10,）

表1 九味麝香丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹試驗(yàn)的影響（n=10,）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 對(duì)小鼠棉球肉芽腫生成的影響

九味麝香丸0.20g/kg 組肉芽干重降低，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示該劑量九味麝香丸具有抑制亞急性炎癥藥效（結(jié)果見(jiàn)表2）。

表2 九味麝香丸對(duì)小鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)的影響（n=10,）

表2 九味麝香丸對(duì)小鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)的影響（n=10,）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 對(duì)DNFB所致小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響

九味麝香丸0.20g/kg 組耳腫脹度和腫脹率均增高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；0.10g/kg 組腫脹率增高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)胸腺和脾則未見(jiàn)明顯影響。該結(jié)果提示九味麝香丸在上述劑量具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用（結(jié)果見(jiàn)表3）。

表3 九味麝香丸對(duì)DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（n=10,）

表3 九味麝香丸對(duì)DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（n=10,）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對(duì)雞紅細(xì)胞所致小鼠溶血素生成的影響

免疫低下模型對(duì)照組OD 值顯著降低，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示免疫低下模型復(fù)制成功；九味麝香丸各劑量灌胃給予13 天，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（結(jié)果見(jiàn)表4）。

表4 九味麝香丸對(duì)雞紅細(xì)胞所致小鼠溶血素生成試驗(yàn)的影響（n=10,）

表4 九味麝香丸對(duì)雞紅細(xì)胞所致小鼠溶血素生成試驗(yàn)的影響（n=10,）

注：與免疫低下模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

藏醫(yī)典籍《四部醫(yī)典》中將傳染性、流行性疾病稱為“年仍奈”，即疫病?！澳耆阅巍本哂邪l(fā)病急驟、病情危篤，傳播速度快，易于流行擴(kuò)散等特點(diǎn)。藏醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“年仍奈”屬于熱病范疇，具有總體癥狀和具體癥狀兩大類。總體癥狀分未成型、擴(kuò)散和空虛三種，發(fā)病初期呈現(xiàn)早期熱癥（未成熟型熱癥），可出現(xiàn)寒顫、肌肉和關(guān)節(jié)酸痛、全身乏力、頭痛等癥狀，類似于SARS、甲型H1N1、禽流感、新型冠狀病毒感染肺炎等傳染性疾病特有的發(fā)熱合并癥狀。藏醫(yī)在疫病治療方面，首先主張要?dú)湟叨局?，再降熱毒之兇，后行調(diào)氣補(bǔ)身。早期治療，首選具有解毒、消炎、清肝火、治腑熱之功效的藥物[1]。藏藥九味黑藥丸是藏醫(yī)防治疫病的經(jīng)典古方，藏醫(yī)通常將其制作為香囊，通過(guò)藥物的揮發(fā)氣味對(duì)鼻腔和呼吸道黏膜進(jìn)行刺激，激發(fā)人體的防御力和調(diào)節(jié)機(jī)制，達(dá)到預(yù)防呼吸道傳染病和治療疾病的效果。［1］藏藥九味麝香丸是在藏藥九味黑藥丸基礎(chǔ)方藥上，通過(guò)名老藏醫(yī)專家貢覺(jué)旺堆指導(dǎo)，按照藏醫(yī)辯證施治、臨證加減配方的用藥指導(dǎo)原則，經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院專家論證確定后形成的配方，具有消炎、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)之功效，口服用于各類疫病包括其他炎癥性疾病引起的頭痛、發(fā)熱、咳嗽，正氣不足，亦可用于中風(fēng)、炭疽等病癥。外用可用于局部抗炎。

本研究以二甲苯所致小鼠急性炎癥模型和棉球皮下植入所致小鼠亞急性炎癥模型，分別考察九味麝香丸對(duì)不同類型炎癥的抗炎效果。結(jié)果顯示，藏藥九味麝香丸既可抑制炎癥急性期的水腫、滲出，也能抑制慢性炎癥所致組織增生，具有明確的抗炎作用，這與其臨床應(yīng)用于一些傳染性疾病早中期相吻合。

此外，尚通過(guò)DNFB 所致小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)和雞紅細(xì)胞所致血清溶血素生成試驗(yàn)以分別考察藏藥九味麝香丸對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。結(jié)果表明，藏藥九味麝香丸對(duì)細(xì)胞免疫有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)體液免疫影響相對(duì)較弱，該作用也有助于臨床易感患者的免疫保護(hù)。

總體而言，藏藥九味麝香丸兼具抗炎和免疫增強(qiáng)作用，對(duì)于各類“年仍奈”可能具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。