基于電子鼻及G C-M S技術(shù)的啤酒識(shí)別研究

謝宇飛，李臻峰，2，李 靜，2，宋飛虎，2，向 昊

(1.江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122)

啤酒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是世界上產(chǎn)量和消費(fèi)量最高的酒精飲料[1]。啤酒的質(zhì)量與很多因素有關(guān)，而最直觀的就是風(fēng)味。啤酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是反映啤酒品質(zhì)的一個(gè)重要特征，也是啤酒產(chǎn)品質(zhì)量的重要組成部分。不同品牌的啤酒因生產(chǎn)工藝的不同，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分和含量會(huì)有所差異，所以分析風(fēng)味特性在啤酒品質(zhì)鑒別中具有極其重要的地位。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)是檢測(cè)啤酒揮發(fā)性成分的主要技術(shù)之一，能夠?qū)悠窊]發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析[2-3]。但是該方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易對(duì)樣品揮發(fā)性成分造成破壞。電子鼻是一種由傳感器陣列和模式識(shí)別方法組成的人工嗅覺(jué)智能儀器，具有方便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。張君生[4]通過(guò)電子鼻對(duì)新產(chǎn)原酒進(jìn)行等級(jí)評(píng)判，并利用PLSR實(shí)現(xiàn)總酸、總酯含量的預(yù)測(cè)。Shi[5]對(duì)5種啤酒PEN3電子鼻數(shù)據(jù)深度特征進(jìn)行挖掘，提高了電子鼻對(duì)啤酒分類(lèi)的準(zhǔn)確性。但是電子鼻只能從啤酒氣味特征的整體風(fēng)味進(jìn)行分析，具有一定的局限性。電子鼻與GC-MS兩種分析技術(shù)的配合能夠從宏觀和微觀上研究食品風(fēng)味，是目前食品檢測(cè)的主要手段。劉芳[6]采用電子鼻與GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)7種不同品牌濃香型白酒進(jìn)行很好區(qū)分，發(fā)現(xiàn)PCA分析中關(guān)系密切的樣品在風(fēng)味成分層面也存在相似性。Cao[7]利用電子鼻與GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)4種楊梅果酒進(jìn)行鑒別分析，發(fā)現(xiàn)不同品種楊梅果酒風(fēng)味特征存在差異。這些研究利用電子鼻與GC-MS技術(shù)研究酒類(lèi)的識(shí)別分類(lèi)和揮發(fā)性成分的組成，但是并沒(méi)有分析電子鼻傳感器與GCMS檢測(cè)出的揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性，且電子鼻與GC-MS技術(shù)檢測(cè)啤酒風(fēng)味成分的研究相對(duì)較少。

本研究以市售5種品牌的啤酒為研究對(duì)象，運(yùn)用PEN3電子鼻進(jìn)行氣味檢測(cè)分析，通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)樣品氣味信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并建立判別模型，研究電子鼻區(qū)分識(shí)別不同品牌啤酒的可行性。結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，使用PLSR建立揮發(fā)性化合物和電子鼻響應(yīng)信號(hào)之間的相關(guān)性。為區(qū)分啤酒品牌及電子鼻傳感器與揮發(fā)性成分之間相關(guān)性的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒樣：選取5種不同品牌的淡爽型啤酒為實(shí)驗(yàn)材料，詳細(xì)信息如表1所示。

表1 5種不同品牌啤酒樣品信息

儀器設(shè)備：GC-MS聯(lián)用儀，日本島津公司。

PEN3型電子鼻：德國(guó)AIRSENSE公司，含有10個(gè)金屬氧化物傳感器，能夠?qū)κ称泛惋嬃现写蠖鄶?shù)揮發(fā)性化合物進(jìn)行交叉響應(yīng)。表2顯示了每個(gè)傳感器的靈敏度特性。

表2 傳感器名稱(chēng)及其性能描述

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電子鼻檢測(cè)

在20 ℃±0.5 ℃的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，取5 mL待測(cè)樣品于40 mL頂空色譜進(jìn)樣瓶中靜置20 min，確保瓶?jī)?nèi)氣體飽和。設(shè)置采樣間隔1 s；沖洗時(shí)間60 s；零點(diǎn)調(diào)整時(shí)間5 s；測(cè)量時(shí)間100 s；預(yù)采樣時(shí)間5 s；注射流量300 mL/min。5種品牌啤酒各取15個(gè)平行樣，共計(jì)75個(gè)樣本，待測(cè)樣本重復(fù)測(cè)定3次取平均值，消除測(cè)量誤差。

1.2.2 風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

萃取條件：吸取經(jīng)除氣處理的各酒樣5 mL于20 mL固相微萃取專(zhuān)用頂空進(jìn)樣瓶中，添加10 μL規(guī)格為50 mg/L的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)并加入1.5 g NaCl促進(jìn)有機(jī)相和水相分離。密封后于50 ℃下平衡5 min，插入萃取頭萃取30 min，萃取完成以后，解析1 min。

GC條件：DB-WAXETR色譜柱（60 m×0.050 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，以純度為99.999%的高純度氦氣為載氣，流速1 mL/min。分流比5∶1。升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min的升溫速率升至180 ℃，再以20 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min。

MS條件：EI電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30～350 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品牌啤酒樣品電子鼻分析

2.1.1 電子鼻響應(yīng)值結(jié)果分析

啤酒樣品電子鼻響應(yīng)值曲線(xiàn)如圖1所示，傳感器的初始狀態(tài)均為1，由于頂空進(jìn)樣瓶中樣品香氣成分的富集，經(jīng)過(guò)10 s的反應(yīng)時(shí)間響應(yīng)值快速上升，并在40 s時(shí)趨于穩(wěn)定，提取穩(wěn)定階段的95 s時(shí)響應(yīng)值作為分析特征值。

圖1 電子鼻對(duì)啤酒樣品的響應(yīng)曲線(xiàn)

不同品牌樣品的電子鼻響應(yīng)曲線(xiàn)都有相同的變化趨勢(shì)，說(shuō)明不同品牌啤酒樣品的揮發(fā)性成分類(lèi)似，主要區(qū)別為含量的差異[6]。各傳感器對(duì)啤酒香氣的響應(yīng)程度不同，R6傳感器響應(yīng)值最高，表明啤酒當(dāng)中甲基類(lèi)化合物含量較多，酯類(lèi)物質(zhì)是啤酒當(dāng)中種類(lèi)最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，推測(cè)R6傳感器可能和酯類(lèi)物質(zhì)相關(guān)[8]。其次為R9、R2、R7、R8和R1傳感器，表明啤酒可能含有較高的醇類(lèi)、硫化物、萜烯和芳香族化合物[9]。R10傳感器對(duì)啤酒香氣的響應(yīng)值非常低，趨近于基線(xiàn)，說(shuō)明對(duì)樣品香氣檢測(cè)的貢獻(xiàn)較小。

圖2為各樣品傳感器95 s響應(yīng)值的平均值，展示不同品牌啤酒之間電子鼻響應(yīng)值的差異性。電子鼻主要通過(guò)R1、R2、R6、R7、R8和R9傳感器顯示出區(qū)分不同品牌啤酒的良好能力。R3、R4和R5傳感器雖然對(duì)啤酒香氣具有響應(yīng)值，但樣品之間差異性較小，直觀上不具備區(qū)分樣品的能力。WH樣品的R6傳感器響應(yīng)值顯著高于其他4種，因此WH樣品中可能含有的甲基類(lèi)物質(zhì)最多。R8傳感器對(duì)醇類(lèi)敏感，推測(cè)QD樣品生成的醇類(lèi)物質(zhì)最多。僅通過(guò)觀察傳感器響應(yīng)值無(wú)法區(qū)分不同品牌啤酒，因此，有必要進(jìn)一步利用PCA和FDA進(jìn)行分析。

圖2 5種品牌啤酒的電子鼻響應(yīng)值

2.1.2 主成分分析

主成分分析（PCA）是比較常用的分析和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)方法，是在不丟失大部分樣品氣味信息的條件下，選取少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)來(lái)代替原來(lái)的變量，從而簡(jiǎn)化變量之間的關(guān)系[10]。因此，在盡可能保留有用信息的前提下，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，提高樣品區(qū)分度。

將電子鼻十個(gè)傳感器的95 s穩(wěn)態(tài)響應(yīng)值作為特征值進(jìn)行主成分分析，前兩個(gè)主成分PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為90.99 %和7.02 %，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到98.01 %，說(shuō)明主成分PC1和PC2包含了原始樣品98.01%的信息。如圖3所示，5種啤酒樣品均能聚集在一起，分布于各自獨(dú)立的區(qū)域，說(shuō)明不同品牌啤酒樣品風(fēng)味特征不同。

圖3 基于電子鼻不同品牌啤酒PCA分析

PCA中樣品間的距離表征差異，SH與HB、QD與GZ的第一主成分接近，樣本之間的差異主要體現(xiàn)在第二主成分上。GZ與WH的第二主成分接近，主要差異體現(xiàn)在第一主成分上。第一主成分的方差貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于第二主成分，表明PC1軸上的距離越大，樣品的差異性越大，SH、HB均與WH樣品在PC1軸上的距離最遠(yuǎn)，由此判斷SH、HB與WH在氣味上的差別最為明顯。若樣品間的主要差異性體現(xiàn)在第二主成分上，其實(shí)際差異較小，說(shuō)明SH和HB、QD和GZ的香氣特征差別較小。主成分分析中，雖然樣品間間距較小，但是邊界區(qū)域無(wú)重疊，表明電子鼻與PCA分析技術(shù)能實(shí)現(xiàn)啤酒揮發(fā)性成分初步鑒別。

圖4為PC1和PC2相應(yīng)的載荷分析圖，在載荷分析圖中，各傳感器在橫縱坐標(biāo)上的投影可以反映其對(duì)樣品揮發(fā)性氣味貢獻(xiàn)率的大小，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的傳感器對(duì)PCA的貢獻(xiàn)越大，反之則越小[11]。PEN3的十個(gè)傳感器中，對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)最大的是R6(對(duì)甲基類(lèi)敏感)，對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)最大的是R9(對(duì)芳香成分敏感)。R3、R4、R5和R10傳感器趨近于坐標(biāo)原點(diǎn)，表明這四個(gè)傳感器對(duì)啤酒揮發(fā)性香氣成分差異性區(qū)分的貢獻(xiàn)度低，只需要R1、R2、R6、R7、R8和R9六個(gè)傳感器就可以完成樣品的區(qū)分和鑒別。結(jié)合圖2 PCA分析結(jié)果，SH與HB、QD與GZ樣品的差異性主要體現(xiàn)在芳香類(lèi)物質(zhì)上，與WH樣品的差異性主要體現(xiàn)在甲基類(lèi)物質(zhì)上。

圖4 基于電子鼻不同品牌啤酒的載荷圖

2.1.3 Fisher判別分析

Fisher判別分析（FDA）通過(guò)函數(shù)優(yōu)化重組傳感器數(shù)據(jù)，去除對(duì)提高識(shí)別能力沒(méi)有貢獻(xiàn)或貢獻(xiàn)很小的傳感器數(shù)據(jù)，得到新的典型變量，使群體之間的差異最大化，并確保群體內(nèi)部的差異最小化，從而使各個(gè)群體間的重心距離最大，進(jìn)一步提高傳感器識(shí)別能力[12]。將75個(gè)啤酒樣品按2∶1分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，得到50個(gè)訓(xùn)練集樣本，25個(gè)測(cè)試集樣本。

經(jīng)過(guò)Fisher判別分析以后得到4個(gè)判別函數(shù)，對(duì)判別模型的貢獻(xiàn)率分別為70.0%、19.1%、9.2%和1.7 %。前兩個(gè)判別函數(shù)的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.1%，包含了5種啤酒樣品的主要信息，可以描述不同品牌啤酒之間風(fēng)味物質(zhì)特征的差異與聯(lián)系。因此，選用前兩個(gè)判別函數(shù)對(duì)5種啤酒進(jìn)行分類(lèi)。結(jié)果如圖5所示，橢圓區(qū)域內(nèi)各樣品分布趨勢(shì)各不相同，相比于PCA分析結(jié)果，5種啤酒分布區(qū)間更為分散，樣品集中性更強(qiáng)，分類(lèi)效果明顯，為了驗(yàn)證Fisher判別分析的準(zhǔn)確率，采用貝葉斯（bayes）判別函數(shù)對(duì)5種不同產(chǎn)地的啤酒進(jìn)行分類(lèi)，準(zhǔn)確率高達(dá)93 %，表明Fisher判別分析優(yōu)于PCA，是更適用于電子鼻對(duì)啤酒品牌區(qū)分的統(tǒng)計(jì)分析工具。

圖5 基于電子鼻不同品牌啤酒的FDA分析

2.2 啤酒揮發(fā)性成分的GC-MS分析

電子鼻雖然能夠?qū)ζ【茪馕短卣魉淼恼w風(fēng)味進(jìn)行分析，可以直觀的反映不同品牌啤酒的差異性和相似性，但是對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量的分析卻受到了限制[13]。為了進(jìn)一步研究啤酒樣品間風(fēng)味成分之間的差異，使用GCMS對(duì)5種啤酒進(jìn)行測(cè)定，共鑒定出24種酯類(lèi)、16種醇類(lèi)、13種酸類(lèi)、10種醛類(lèi)、12種烷類(lèi)、7種酮類(lèi)以及13種芳香族化合物等揮發(fā)性物質(zhì)，啤酒揮發(fā)性成分中主要的呈香物質(zhì)通常為酯類(lèi)、醇類(lèi)和酸類(lèi)[14]。5種啤酒的主要揮發(fā)性成分的種類(lèi)大體相同，但是各組分含量有所區(qū)別。

聚類(lèi)熱圖可以直觀的展示啤酒風(fēng)味物質(zhì)含量的差異，在啤酒揮發(fā)性成分中種類(lèi)最為豐富的是酯類(lèi)物質(zhì)，是啤酒香氣和風(fēng)味的最重要的貢獻(xiàn)者[15]。WH樣品中酯類(lèi)物質(zhì)含量最高，與電子鼻R6傳感器結(jié)果一致，但是HB酯類(lèi)含量高于QD和SH，與電子鼻結(jié)果具有差異性，可能是多種揮發(fā)性成分對(duì)R6傳感器交叉響應(yīng)的結(jié)果。圖6是啤酒酯類(lèi)物質(zhì)含量歸一化后繪制的聚類(lèi)熱點(diǎn)圖，通過(guò)酯類(lèi)物質(zhì)對(duì)不同品牌啤酒進(jìn)行進(jìn)一步的聚類(lèi)分析。WH樣品和GZ樣品的酯類(lèi)物質(zhì)含量最高，WH樣品中辛酸異戊酯、癸酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸庚酯、丁酸異戊酯和丁酸乙酯含量顯著高于其他4種樣品，被單獨(dú)歸為一類(lèi)。GZ樣品中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯及乙酸苯乙酯和其他四種樣品差異性顯著，并含有甲酸辛酯特征風(fēng)味物質(zhì)，被歸為一類(lèi)。HB、SH、QD的啤酒酯類(lèi)含量相對(duì)較低，酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及含量大致相同，被歸為一類(lèi)。

圖6 不同品牌啤酒酯類(lèi)物質(zhì)聚類(lèi)分析

醇類(lèi)對(duì)啤酒的風(fēng)味感知起著重要作用，通常由酵母代謝麥汁中的氨基酸和糖類(lèi)產(chǎn)生，且高級(jí)醇也是更具風(fēng)味活性的酯的前驅(qū)體[16]。5種啤酒樣品中總醇相對(duì)百分含量為WH 21.11 %、QD 24.97 %、SH 18.31 %、HB 20.56 %、GZ 22.02 %，QD樣品的醇類(lèi)物質(zhì)含量最高，與電子鼻檢測(cè)結(jié)果一致。由圖7可知，5種啤酒通過(guò)醇類(lèi)物質(zhì)可以分為兩大類(lèi)，樣品WH含有L-薄荷醇、異蒲勒醇、里哪醇等其他4種啤酒所沒(méi)有的特征風(fēng)味物質(zhì)，被單獨(dú)歸為一類(lèi)。HB、QD、SH、GZ的4種啤酒醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量較為相近，被歸為一類(lèi)。

圖7 不同品牌啤酒醇類(lèi)物質(zhì)聚類(lèi)分析

啤酒中的酸類(lèi)物質(zhì)主要在麥芽糖化過(guò)程和酵母菌代謝中形成，對(duì)啤酒的呈味起著至關(guān)重要的作用[17]。在5種啤酒中，總酸相對(duì)百分含量為WH 11.28%、QD 11.94%、SH 12.34%、HB 11.08%和GZ 8.56%。如圖8所示，酸類(lèi)物質(zhì)可以大致分為兩類(lèi)，WH樣品由于酸類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)高于其他4種啤酒，具有α-亞麻酸、壬酸等特征酸類(lèi)物質(zhì)，且主要的酸類(lèi)物質(zhì)乙酸、正己酸、正癸酸、月桂酸等含量高于其他種類(lèi)啤酒，單獨(dú)歸為一類(lèi)。HB、QD、SH、GZ 4種啤酒酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量相近，被歸為一類(lèi)。

圖8 不同品牌啤酒酸類(lèi)物質(zhì)聚類(lèi)分析

2.3 電子鼻數(shù)據(jù)與揮發(fā)性化合物的相關(guān)性

偏最小二乘回歸（PLSR）是一種多元線(xiàn)性回歸方法，用于因變量與自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系[18]。為了研究電子鼻傳感器與啤酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，利用PLSR建立電子鼻響應(yīng)值與啤酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的雙因素模型，如圖9所示，解釋了X矩陣（電子鼻響應(yīng)值）中的84%的方差和Y矩陣（揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)）中51%的方差。雙標(biāo)圖中揮發(fā)性化合物樣本點(diǎn)與傳感器之間距離越短，表明樣本點(diǎn)和傳感器的相關(guān)性越高[19-20]。R1和R8傳感器分布于第四象限，周?chē)懿贾碱?lèi)，如啤酒中含量最高的高級(jí)醇有異戊醇、反式-橙花叔醇、3-甲硫基丙醇等,表明這兩個(gè)傳感器與這些醇類(lèi)物質(zhì)正相關(guān)，醇類(lèi)可能是影響R1、R8傳感器變化的主要揮發(fā)性成分，與電子鼻特性一致。R4、R9和R10傳感器周?chē)植贾恍┩轭?lèi)，如十六烷基七硅氧烷、十五烷、正十六烷等，表明這幾類(lèi)傳感器與啤酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的烷類(lèi)密切相關(guān)。R5、R6、R3、R7以及R2傳感器周?chē)植贾揭宜嵋阴?、丙酸異戊酯、辛酸異戊酯、棕櫚酸乙酯?-苯丙酸乙酯、正丁醇，表明這幾類(lèi)傳感器的響應(yīng)值與這些化合物正相關(guān)。

圖9 電子鼻傳感器與揮發(fā)性成分的PLSR相關(guān)性

3 結(jié)論

采用PEN3電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）技術(shù)從宏觀和微觀上對(duì)5種品牌啤酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。電子鼻結(jié)合PCA和FDA能夠很好的區(qū)分5種啤酒，R6、R8和R9傳感器起主要區(qū)分作用，F(xiàn)DA對(duì)5種啤酒的區(qū)分度更大，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。GC-MS共鑒定出24種酯類(lèi)、16種醇類(lèi)、13種酸類(lèi)、10種醛類(lèi)、12種烷類(lèi)、7種酮類(lèi)以及13種芳香族化合物等揮發(fā)性物質(zhì)。5種啤酒的主要揮發(fā)性成分的種類(lèi)大體相同，但是各組分含量有所區(qū)別，且在主成分分析結(jié)果中，邊緣區(qū)域相近的樣品其風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量具有一定相似性。根據(jù)偏最小二乘回歸模型，電子鼻與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，醇類(lèi)、酯類(lèi)、烷類(lèi)物質(zhì)是引起傳感器R6、R8和R9變化的主要揮發(fā)性成分。本研究為區(qū)分啤酒品牌及電子鼻傳感器與揮發(fā)性成分之間相關(guān)性的研究提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。