酒用酯化酶利用酒尾生產(chǎn)酯化液研究

張 坤，馬美榮，王小偉

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

酯化酶不是酶學(xué)上的術(shù)語(yǔ)，酶學(xué)上名為解脂酶，是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶及磷酸酯酶的統(tǒng)稱。酯化酶的種類很多，但白酒生產(chǎn)中已應(yīng)用的多為乙酸乙酯合成酶及己酸乙酯合成酶。合成乙酸乙酯的生香酵母分泌的酶為乙酸乙酯合成酶[1-3]。紅曲霉、根霉、毛霉等產(chǎn)生的酯化酶多為己酸乙酯合成酶[4-7]。許多細(xì)菌也能產(chǎn)生酯化酶[8-11]。清香型白酒是以乙酸乙酯為主體香的白酒，采用酶工程技術(shù)生產(chǎn)富含乙酸乙酯的酯化液具有重要的研究?jī)r(jià)值。

酒用酯化酶是華南理工大學(xué)林影教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種酶制劑，該酶用于非水相中催化合成短鏈芳香酯，結(jié)果表明，該酶可催化C10以下的酸和醇直接酯化合成多種短鏈芳香酯[12]，酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90 %以上，該團(tuán)隊(duì)也證實(shí)其在合成己二酸二異辛酯、香葉基丁酸、肉桂醇酯、萜烯醇芳香酯等酯類物質(zhì)方面具有極強(qiáng)的催化能力[13-15]。該酶在黃水利用、丟糟發(fā)酵中得到了良好應(yīng)用[16-17]。

酒尾是白酒蒸餾后期截取的酒精度較高的酒-水混合物。酒尾中含有大量酸味物質(zhì)及高級(jí)脂肪酸酯類，因此酒尾用來(lái)調(diào)整酒的酸度及后味效果明顯。但用量不可過(guò)大，超過(guò)20 %將影響低度酒的透明度，而且會(huì)給酒帶來(lái)酒稍子味[18-19]。

酒尾中富含大量乙醇、酸味物質(zhì)，如能通過(guò)酯化酶生產(chǎn)酯化液，對(duì)提高酒尾的附加值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：酒用酯化酶，華南理工大學(xué)提供；酒尾，北京紅星股份有限公司釀造車間提供；乙酸（AR），購(gòu)自天津市風(fēng)橋化學(xué)試劑科技有限公司。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀（HP6890），安捷倫公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)密度儀（DMA5000M），安東帕公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒精度測(cè)定

采用密度法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 微量成分測(cè)定（氣相色譜儀法）

色譜條件：DM-WX毛細(xì)管柱，柱溫程序升溫，檢測(cè)器溫度240 ℃，汽化室溫度230 ℃。載氣流速：氮?dú)?5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

1.2.3 酯化酶催化酒尾合成乙酸乙酯

200 mL酒尾中加入5 %的酯化酶，30 ℃酯化1 d、2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.4 酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

192 mL酒尾中加入8 mL乙酸再加入5%的酯化酶，30 ℃酯化1 d、2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.5 不同乙酸用量對(duì)酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

分別按照1%、2%、3%、4%的乙酸比例配制酒尾、乙酸混合液，再加入5%的酯化酶，30 ℃酯化2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.6 溫度對(duì)酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，加入5 %的酯化酶，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃酯化2 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.7 不同酯化酶用量對(duì)酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，再分別加入1 %、2 %、3 %、4 %、5 %的酯化酶，30 ℃酯化2 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.8 酯化酶酶活穩(wěn)定性

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，再加入3 %的酯化酶，30 ℃酯化2 d，酯化液分離后的酶繼續(xù)加入同樣比例的酒尾、乙酸，30 ℃酯化2 d。直至酯化液中乙酸乙酯含量大幅下降，停止實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒尾成分分析(表1)

表1 酒尾成分分析

該酒尾的酒精度為26%vol，酒尾中除含有水、乙醇外，還含有種類眾多的微量成分。在所檢測(cè)條件下，在該酒尾中共檢測(cè)到36種微量成分，其中醛類4種，酮類3種，酯類7種、醇類13種、酸類7種，烷類2種，乳酸乙酯的含量最高，為4663.75 mg/L，其次為乙酸、乙酸乙酯，含量分別為3669.09 mg/L、1118.51 mg/L，這3種物質(zhì)的含量占總微量成分的84.83%。酒尾中含有較豐富的乙酸、乙醇，為酯化酶催化乙酸乙酯合成提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 酯化酶利用酒尾合成乙酸乙酯

根據(jù)酶用量推薦量、酶作用的推薦溫度，在酒尾中加入5 %酯化酶在30 ℃下酯化的結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在酒尾中加入酯化酶后，乙酸含量下降明顯，乳酸乙酯下降幅度也大，但乙酸乙酯增加量不大，最高增加約0.36 g/L，與預(yù)期差別較大，可能是因?yàn)榫莆仓谐煞直容^復(fù)雜，酯化酶催化乙酸、乙醇合成乙酸乙酯的活性受到其他成分的影響。

圖1 酯化酶利用酒尾合成乙酸乙酯

2.3 酯化酶利用酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

酒尾直接加入酯化酶酯化效果一般，酒尾中乙醇含量應(yīng)該是過(guò)量的，可能是由于乙酸含量不足導(dǎo)致酯化效果不佳。因此在酒尾中加入乙酸，探討加入乙酸是否有利于酯化合成。加入乙酸后，由于反應(yīng)體系中乙酸濃度過(guò)高，所采用的色譜條件不能準(zhǔn)確反映酯化液中的乙酸含量，且本研究主要關(guān)注酯類物質(zhì)變化，故此后實(shí)驗(yàn)不再對(duì)酯化液中的乙酸含量進(jìn)行分析比較。從圖2可看出，酒尾中加入乙酸再用酯化酶酯化乙酸、乙醇，酯化液中乙酸乙酯含量大幅增加。隨著酯化時(shí)間增加，乙酸乙酯含量在第2天達(dá)到最高，第3天又下降，乳酸乙酯隨著酯化時(shí)間增加，前兩天下降幅度大。經(jīng)比較酯化液中乙酸乙酯、乳酸乙酯含量，在本酯化條件下，酯化2 d比較合適。在本研究條件下，該酯化體系具有增加乙酸乙酯降低乳酸乙酯效果。

圖2 酯化酶利用酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

2.4 不同乙酸用量對(duì)酯化酶酯化酒尾的影響（表2）

表2 不同乙酸用量對(duì)酯化酶酯化酒尾的影響

采用不同的乙酸用量，比較2 d和3 d的酯化結(jié)果，都是隨著反應(yīng)時(shí)間增加，乙酸乙酯含量反而下降，乳酸乙酯含量也下降。從結(jié)果來(lái)看，采用本研究體系，酯化時(shí)間以2 d為宜。從反應(yīng)2 d的結(jié)果來(lái)看，酯化反應(yīng)體系中乙酸用量每增加約10 g/L，乙酸乙酯含量約增加3 g/L。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需求，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用3%的乙酸用量。

2.5 溫度對(duì)酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

溫度既影響酶的催化反應(yīng)速度，又影響酶的活性。參考資料[17]，采用25 ℃、30 ℃、35 ℃考察溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響。從圖3可以看出，從25 ℃到30 ℃，隨著反應(yīng)溫度升高，乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量增加，但從30 ℃到35 ℃，隨著反應(yīng)溫度升高，乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量降低，這說(shuō)明高溫并不利于酯化反應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酯化溫度確定為30 ℃。

圖3 溫度對(duì)酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

2.6 不同酯化酶用量對(duì)酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

在酒尾中加入3%乙酸后，通過(guò)添加不同量的酯化酶，考察酶用量對(duì)酯化的影響見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，酶作為反應(yīng)的主要限制性因素，酶添加量對(duì)乙酸乙酯的生成有很大的影響。隨著酶添加量的增加，乙酸乙酯的含量先增加再趨于平穩(wěn)，當(dāng)酶用量超過(guò)3 %（W/V）時(shí)，乙酸乙酯的含量不增加，還略微下降，從數(shù)據(jù)來(lái)看，乳酸乙酯的含量隨著酶用量的增加是逐步增加的，但增加幅度不大?？紤]到清香型白酒的主體香為乙酸乙酯，結(jié)合酶的成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用3%的酶用量。本研究的酶用量研究結(jié)果不同于脂肪酶酯化白酒黃水的酶用量研究結(jié)果，這可能是與兩者的化學(xué)組成差別大有關(guān)，且與黃水中含有各種微生物有關(guān)[20]。

圖4 酯化酶用量對(duì)酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

2.7 酯化酶酶活性穩(wěn)定性

為了提高酯化酶的使用效率，降低生產(chǎn)成本，進(jìn)行了該酶酶活穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，前4批重復(fù)實(shí)驗(yàn)的酯化液乙酸乙酯含量基本保持穩(wěn)定。第5批重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，酯化液中乙酸乙酯含量大幅下降，比第1批實(shí)驗(yàn)降低了18.92 %。各批重復(fù)實(shí)驗(yàn)酯化液的乳酸乙酯含量差別不大。該酶在酒尾、乙酸酯化體系下，具有較好的酶活性穩(wěn)定性。該酶能回收利用，將極大降低酶的使用量，降低生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)酒尾微量成分分析，酒尾中含有較豐富的乙酸、乙醇，為采用酒用酯化酶催化乙酸乙酯合成提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)乙酸用量、溫度、酶用量、酯化時(shí)間對(duì)反應(yīng)影響研究，確定酯化酶酯化酒尾、乙酸的條件為：乙酸用量3%，溫度30 ℃，酯化酶用量3%，酯化2 d。該酯化工藝作用溫和，反應(yīng)周期短，酯化液中乙酸乙酯含量高，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。