不同浸漬發(fā)酵方式對(duì)紅葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)及感官特征的影響

丁 燕，韓曉梅，王超萍，王欽超

（1.山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100；2.山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100；3.龍口省級(jí)農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會(huì)，山東煙臺(tái) 265701）

葡萄酒中的酚類物質(zhì)，如花色苷、原花色素等的含量、結(jié)構(gòu)、聚合度、沒食子?；鹊葘?duì)葡萄酒感官特性，如色澤、澄清度、酒體、苦澀味以及陳釀潛力等都具有直接或間接的重要影響[1-2]。葡萄酒中的這些酚類物質(zhì)主要來(lái)源于葡萄皮和葡萄籽，發(fā)酵過程中通過皮渣浸漬作用等進(jìn)入葡萄酒中[1]。葡萄原料中酚類物質(zhì)的含量、種類、聚合度、結(jié)構(gòu)等則會(huì)因葡萄品種、組織部位、葡萄成熟度等的不同而有差異，如花色苷一般主要存在于葡萄皮中，而原花色素在葡萄皮和葡萄籽中都有。此外，葡萄皮和葡萄籽中原花色素的含量、結(jié)構(gòu)也都不同，比如葡萄皮原花色素中含有原飛燕草素（Prodelphinidins），而葡萄籽中則沒有；葡萄皮原花色素的平均聚合度（mDP）一般為20，而葡萄籽中的平均聚合度一般為5～8；葡萄皮原花色素的沒食子?；纫话愕陀谄咸炎眩黄咸哑ぶ性ㄉ貥?gòu)成單元主要由CAT、EC、ECG、EGC等組成，而葡萄籽中則主要由CAT、EC、ECG等組成[3-4]。而且花色苷與原花色素之間的反應(yīng)會(huì)有利于葡萄酒色澤的穩(wěn)定以及口感的細(xì)膩圓潤(rùn)。此外，葡萄酒釀造過程中酚類物質(zhì)與香氣物質(zhì)之間也能發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，從而影響葡萄酒的香氣。

香氣是評(píng)判葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。葡萄酒中的香氣形成機(jī)制復(fù)雜，主要包括：葡萄果實(shí)自身的香氣成分；發(fā)酵前浸漬過程中的氧化和水解反應(yīng)；酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵期間的微生物代謝；葡萄酒陳釀貯存期間的化學(xué)或酶反應(yīng)等[5]。直接源于葡萄果實(shí)的香氣物質(zhì)稱為品種香氣，決定了葡萄酒的品種典型性和產(chǎn)地風(fēng)格，這部分品種香氣成分主要存在于葡萄皮中[6-7]。

除了葡萄原料之外，釀造過程中發(fā)酵溫度、皮渣浸漬時(shí)間、低溫預(yù)發(fā)酵工藝、皮汁比調(diào)整、浸漬酶添加等不同的釀酒工藝，都會(huì)影響成品葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量及組成[8-9]。眾所周知，葡萄籽中的單寧相比葡萄皮單寧更為苦澀，釀造過程中如果對(duì)葡萄籽單寧過度浸提將不利于葡萄酒的品質(zhì)，尤其是在葡萄原料成熟度不足的情況下會(huì)使得大量粗澀的劣質(zhì)單寧進(jìn)入酒中。因此對(duì)于葡萄成熟度欠佳的原料或者是用葡萄籽單寧特別豐富的葡萄品種釀酒時(shí)，探索如何適當(dāng)縮短浸漬時(shí)間或在合適的時(shí)間去除葡萄籽對(duì)于葡萄酒感官品質(zhì)的改善具有重要的意義?；诖?，本試驗(yàn)以黑比諾葡萄為原料，主要研究分析了浸漬發(fā)酵初期去籽處理對(duì)葡萄酒中多酚和香氣物質(zhì)等風(fēng)味成分的含量、組成，以及感官特性，尤其是顏色以及苦澀味的影響，以期對(duì)葡萄酒釀造工藝的改進(jìn)提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：選用黑比諾釀酒葡萄作為原料，2017年3月采自新西蘭林肯大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃。

菌種：酵母RC212，法國(guó)拉曼公司。

試劑及耗材：亞硫酸，食品級(jí)；所有的色譜試劑均為HPLC級(jí)；丙酮、甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、二氯甲烷，HPLC色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表?xiàng)攦翰杷亍?-)-表?xiàng)攦翰杷貨]食子酸酯、三氟乙酸、抗壞血酸、醋酸鈉、間苯三酚、正辛醇等，均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Toyopearl HW-50(F)，購(gòu)自日本Tosoh公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電導(dǎo)度18 M）。

儀器設(shè)備：Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA），美國(guó)Waters公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-2010 ULTRA，日本Shimadzu公司；Multifuge X1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；Eyela N 1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela公司；Labconco Centrivap真空離心濃縮儀，美國(guó)Labconco公司；Christ Alpha 1-4 LSC plus冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同浸漬發(fā)酵方式釀造試驗(yàn)

帶籽浸漬發(fā)酵處理（WS）：葡萄原料除梗破碎，加入60 mg/L SO2，添加200 mg/L酵母，20 ℃浸漬發(fā)酵，當(dāng)酒精度達(dá)到約6%vol時(shí)（浸漬發(fā)酵開始3 d左右）開始進(jìn)行瀝淌處理，倒罐并回混，當(dāng)比重降到0.992～0.996時(shí)進(jìn)行皮渣分離，進(jìn)入后酵，待還原糖降至2 g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵，下膠澄清，過濾，低溫儲(chǔ)存，3個(gè)月之后取樣分析。

去籽浸漬發(fā)酵處理（WOS）：釀酒操作流程基本同WS處理，不同之處在于，開始進(jìn)行瀝淌處理時(shí)，隨著處理除去沉降在底部的葡萄籽。

1.2.2 葡萄酒理化指標(biāo)分析

酒精含量、pH值以及可滴定酸：參照王華[10]的方法。色度、色調(diào)測(cè)定參照李素岳[11]的方法?？傤慄S酮的測(cè)定參照Peinado等[12]的方法；總黃烷醇的測(cè)定參考Li等[13]的DMACA-HCl法；總花色苷測(cè)定采用pH示差法[14]。

1.2.3 葡萄酒中原花色素分離與測(cè)定

參考Pastor del Rio等[15]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。取5 mL葡萄酒樣品，真空濃縮儀濃縮，用3 mL水∶乙酸（98∶2，v/v）重溶，上Waters C18固相萃取小柱。樣品完全吸附后，用20 mL水∶乙酸（98∶2，v/v）洗柱，再用10 mL甲醇洗脫，得到的甲醇洗脫液進(jìn)行真空旋蒸，凍干成粉。用1 mL甲醇重溶，置于2 mL棕色樣品瓶中，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

間苯三酚酸催化降解反應(yīng)：取100 μL甲醇重溶液，加入100 μL間苯三酚反應(yīng)試劑，50 ℃水浴反應(yīng)20 min后，加入400 μL 0.2 mol/L醋酸鈉溶液，終止反應(yīng)。間苯三酚反應(yīng)試劑的配制：0.2 mol/L鹽酸甲醇溶液，含100 g/L間苯三酚和20 g/L抗壞血酸。

HPLC分析條件：參考Ducasse等[16]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。Waters Atlantis dC18（250 mm×4.6 mm×5 μm）色譜柱，Waters保護(hù)柱（20 mm×4.6 mm×5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，以(+)-兒茶素為標(biāo)品，進(jìn)行外標(biāo)法定量[4，26]。梯度洗脫：流動(dòng)相A：水∶甲酸（98∶2，v/v），流動(dòng)相B：乙腈∶流動(dòng)相A（80∶20，v/v）。洗脫程序：0～5 min，0%B；5～35 min，0%～10 % B；35～70 min，10 %～20 % B；70～75 min，20%～100%B；75～80 min，100%～0%B。

1.2.4 香氣物質(zhì)分析檢測(cè)

香氣成分提?。簠⒄沾奕諏毜萚17]的方法。取酒樣，加入內(nèi)標(biāo)物正辛醇50 μL，分別用50 mL、30 mL、20 mL二氯甲烷萃取3次，每次萃取30 min，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉脫水，在40 ℃下旋蒸至2～3 mL左右，氮?dú)鉂饪s至0.5 mL，供GC-MS分析，進(jìn)樣量1 μL。

GC-MS條件參考張志龍等[18]的方法，并稍加修改：Rxi-Wax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）（Restek公司，美國(guó)）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣，檢測(cè)器(FID)溫度280 ℃。程序升溫：60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持21 min。電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～450 m/z。

香氣成分定性：通過計(jì)算機(jī)檢索與NIST 17和NIST 11S質(zhì)譜庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照進(jìn)行確認(rèn)，保留匹配度大于80%的物質(zhì)用作進(jìn)一步化合物定性鑒定，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道中的線性保留指數(shù)LRI進(jìn)行定性分析。

香氣成分定量：采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各揮發(fā)性成分進(jìn)行半定量分析[19]。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：內(nèi)標(biāo)物正辛醇（色譜純），用無(wú)水乙醇將其配制成濃度為4.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，吸取50 μL正辛醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入50 mL酒樣中，則其在酒樣中濃度為4.15 mg/L。

計(jì)算公式：

香氣成分含量(mg/L)＝f(校正因子，設(shè)為1)×各組分峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度(酒樣中)/內(nèi)標(biāo)峰面積

1.2.5 感官分析

由10名品酒員組成品評(píng)小組，在正式感官評(píng)定前，先用酒石酸、硫酸奎寧、硫酸鋁等配制不同濃度的模擬酒液，分別進(jìn)行酸味、苦味、澀味的品評(píng)訓(xùn)練。然后再對(duì)不同浸漬時(shí)間處理的葡萄酒樣品進(jìn)行感官品評(píng)分析，主要對(duì)酒樣的色度、花香、果香、澀味以及苦味進(jìn)行評(píng)價(jià)和描述，采取5分制，分值越大表示強(qiáng)度最高。根據(jù)定量描述分析結(jié)果繪制蛛網(wǎng)圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。通過鄧肯檢驗(yàn)和ANOVA方差分析法進(jìn)行變量間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同浸漬發(fā)酵處理對(duì)葡萄酒中多酚物質(zhì)的影響（表1）

由表1可見，去籽浸漬發(fā)酵對(duì)酒精度、可滴定酸、pH值等幾乎沒有影響，而與此相反，Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，去籽發(fā)酵的美樂葡萄酒的酒精度、pH值等有所上升。不同處理之間的色度、色調(diào)、總花色苷含量沒有顯著差異，這可能是由于葡萄皮和葡萄籽中多酚浸提過程是相對(duì)獨(dú)立的，去籽浸漬發(fā)酵不會(huì)影響葡萄皮中花色苷的提取率，不過也有研究發(fā)現(xiàn)[20]，去籽發(fā)酵處理的葡萄酒中總花色苷含量有所上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能是與采用的葡萄品種不同有關(guān)。去籽處理會(huì)使種子單寧減少而有利于果膠分解，從而有助于葡萄皮中花色苷和單寧的浸提。與果皮顏色較深的葡萄品種不同，本試驗(yàn)采用的黑比諾葡萄的果皮顏色相對(duì)較淺，花色苷含量也相對(duì)較低，而且葡萄皮多酚的提取比較快，因此在發(fā)酵早期去除葡萄籽時(shí)葡萄皮花色苷可能已經(jīng)得到了較大提取，因此即便進(jìn)行去籽處理可能對(duì)最終的花色苷含量也產(chǎn)生不了較大影響。此外，從表1中還可以看出，帶籽浸漬發(fā)酵處理酒樣WS中總類黃酮含量、原花色素含量以及總黃烷醇含量要顯著高于不帶籽浸漬發(fā)酵處理的酒樣WOS，這些結(jié)果與Vrhovsek等[21]的研究結(jié)果相一致。

2.2 不同浸漬發(fā)酵處理對(duì)葡萄酒中原花色素的影響（圖1）

從圖1可以看出，WS處理酒樣中的原花色素含量和沒食子酰化度要顯著高于WOS處理，而平均聚合度mDP則低于WOS處理。兩個(gè)處理酒樣中原花色素的延伸構(gòu)成單元EGC（(-)-表?xiàng)攦翰杷兀瑏?lái)源于葡萄皮）和末端構(gòu)成單元ECG（表兒茶素沒食子酸酯，來(lái)源于葡萄籽）的摩爾比例存在顯著差異，延伸單元ECG（主要來(lái)源于葡萄籽）的摩爾比例略高于WS處理，但沒有明顯差異。這與文獻(xiàn)報(bào)道[20，22-23]的葡萄皮和葡萄籽多酚組成的差異一致。葡萄籽原花色素的聚合度一般要低于葡萄皮原花色素聚合度，因此去籽浸漬發(fā)酵使得縮合單寧的含量有所降低，而平均聚合度有所上升。此外，葡萄籽原花色素的沒食子?；纫话阋哂谄咸哑ぴㄉ氐臎]食子?；萚22]，因此該實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)WOS處理的酒樣中的原花色素沒食子酸酰化度有所降低。

圖1 不同浸漬發(fā)酵葡萄酒中原花色素（縮合單寧）組成變化

2.3 不同浸漬發(fā)酵處理方式對(duì)葡萄酒中香氣物質(zhì)的影響

通過計(jì)算機(jī)NIST-17、Wiley譜庫(kù)檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行定性（表2）。酒樣中共鑒定出了80多種揮發(fā)性成分，其中對(duì)51種進(jìn)行了定量，其中酯類16種，醇類18種，酸類9種，羰基及苯基衍生物8種。

試驗(yàn)檢測(cè)到了7種萜烯類化合物，包括α-萜品醇、香茅醇、芳樟醇、脫氫芳樟醇、香葉醇、芳樟醇水合物，濃度范圍為0.25～1.68 mg/L。這類化合物具有優(yōu)雅的花香和果香，是葡萄和葡萄酒中尤為重要的一類香氣，或者稱為品種香。這些物質(zhì)的感覺閾值非常低，尤其是芳樟醇和香茅醇，它們對(duì)嗅覺的影響是互相增效的，對(duì)香氣的影響非常重要[24]。WOS處理酒樣中萜烯類物質(zhì)的濃度略高于WS處理，但是沒有顯著差異，而WOS處理酒樣中α-萜品醇和香葉醇含量顯著高于WS處理。

在醇類物質(zhì)中，1-己醇、反式-2-己烯醇和順式-3-己烯醇，具有植物香氣，其感知閾值較低，在葡萄酒香氣表達(dá)中也起很重要的作用[25]。由表2可知，WOS處理酒樣中的1-己醇、順3-己烯醇、反式-2-己烯醇含量較高，顯著高于WS處理，其余醇類物質(zhì)在兩個(gè)處理之間沒有明顯差異。

表2 不同浸漬發(fā)酵處理葡萄酒中的香氣物質(zhì)變化 （mg/L）

酯類物質(zhì)中含量比較高的乙酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸單甲酯、γ-丁內(nèi)酯、琥珀酸二乙酯等給酒帶來(lái)草莓、櫻桃、甜瓜等清新的果香，大多數(shù)酯類物質(zhì)在WOS中含量略高，但兩個(gè)處理之間無(wú)顯著差異。WS處理酒樣中的丁酸、己酸、辛酸、癸酸等中鏈脂肪酸的濃度略高，其中兩個(gè)處理之間的辛酸和己酸濃度存在顯著差異。

WOS處理酒樣中的酯類物質(zhì)含量大約為236.7 mg/L，略高于WS處理；醇類和酸類含量分別為245.1 mg/L、54.01 mg/L，略低于WS處理；其他物質(zhì)含量約為8.32 mg/L，略高于WS處理。WS和WOS之間香氣物質(zhì)的總含量差異較小。

2.4 去籽發(fā)酵對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)的影響（圖2）

圖2 不同浸漬發(fā)酵處理葡萄酒的感官評(píng)價(jià)

對(duì)不同處理酒樣的顏色、香氣、味覺等感官特征進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果表明，兩個(gè)處理之間的顏色、苦味、澀味、酒體等都有顯著差異，尤其是WS處理的苦味和澀味要高于WOS處理酒樣，這與前面的酚類物質(zhì)，尤其是原花色素的含量和組成差異結(jié)果相一致。從圖2可以看出，WOS處理花香、果香等的香氣評(píng)價(jià)略好于WS處理，但兩者之間沒有顯著差異；WS的顏色濃度評(píng)價(jià)略比WOS高，但差異不明顯。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)黑比諾葡萄酒浸漬發(fā)酵開始約3 d后（酒精度達(dá)到約6%vol左右時(shí)）結(jié)合瀝淌處理進(jìn)行去籽處理，研究其對(duì)葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)及感官品質(zhì)，尤其是顏色、苦澀味等的影響。結(jié)果表明，去籽（WOS）和帶籽浸漬處理（WS）之間的酒精度、總酸、顏色以及花色苷的含量沒有顯著差異，但是去籽處理會(huì)顯著影響葡萄酒中其他多酚物質(zhì)的含量及組成。去籽處理酒樣中的總類黃酮、黃烷類以及原花色素等物質(zhì)的含量顯著低于傳統(tǒng)的帶籽浸漬發(fā)酵處理。

帶籽浸漬處理WS酒樣中的原花色素的含量和沒食子?；榷家@著高于WOS處理，而平均聚合度mDP則低于WOS處理；兩個(gè)處理酒樣中原花色素的延伸構(gòu)成單元EGC和末端構(gòu)成單元ECG的摩爾比例存在顯著差異，延伸單元ECG的摩爾比例略高于WS處理，但沒有明顯差異，這與葡萄皮和葡萄籽中單寧的組成差異是有關(guān)的。

發(fā)酵初期去籽處理和帶籽浸漬處理之間的葡萄酒香氣差異較小。WOS處理酒樣中的酯類物質(zhì)含量大約為236.7 mg/L，略高于WS處理；醇類和酸類含量分別為245.1 mg/L、54.01 mg/L，略低于WS處理；其他物質(zhì)含量約為8.32 mg/L，略高于WS處理，但差異不顯著。WOS處理酒樣中有些萜烯類物質(zhì)，如α-萜品醇和香葉醇以及一些具有植物香氣的六碳醇的濃度高于WS處理，而WS處理酒樣中一些中鏈脂肪酸酯的濃度略高。

不同處理酒樣之間的苦味、澀味、酒體等有顯著差異，尤其是帶籽處理的苦味和澀味要高于WOS處理酒樣，這與酚類物質(zhì)，尤其是原花色素的含量和組成差異有關(guān)。去籽處理的香氣評(píng)價(jià)略好于WS處理，而顏色則比WOS處理略低，但差異不明顯。

總之，在浸漬發(fā)酵初期進(jìn)行去籽處理對(duì)葡萄酒的整體香氣沒有顯著影響，但對(duì)酚類物質(zhì)的含量和組成影響較為顯著，從而影響到最終產(chǎn)品的感官特性，尤其是苦味和澀味都有所降低。對(duì)于葡萄原料成熟度不足的情況，采用去籽處理的方式適當(dāng)縮短葡萄籽浸漬時(shí)間可以有效防止釀造過程中葡萄籽單寧的過度浸提，但是同時(shí)也需要考慮這種處理可能給酒帶來(lái)的顏色損失，因此建議去籽處理可以考慮用在原料成熟度不足但花色苷濃度足夠高的葡萄品種的釀酒中。本試驗(yàn)僅選擇了色素含量較低的黑比諾品種作為研究對(duì)象，對(duì)于去籽浸漬發(fā)酵對(duì)其他釀酒品種，尤其是色素含量較高的品種的影響還有待于進(jìn)一步研究，而且去籽量以及去籽時(shí)間可能也會(huì)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)及感官品質(zhì)有影響，也值得深入研究。